随着生活方式及膳食结构等变化,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的患病率日趋上升［1］，对NAFLD的早期诊断、严重程度评估，治疗及判断预后具有重要的临床意义。本研究旨在探讨硫普罗宁和水飞蓟素对轻度NAFLD的作用机制并初步观察两者合用的疗效。 材料与方法 一、材料 (一) 动物健康雄性Wistar大鼠60只，质量(200±20) g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。 (二) 主要试剂SOD试剂盒（批号：20040602）、MDA试剂盒（批号：20040602）均由南京建成生物工程研究所提供。硫普罗宁（商品名：凯西莱）由河南新谊药业公司提供，硫普罗宁用研磨器研磨成粉状，使其药粉溶于蒸馏水中，制成60 g/L的混悬液，大鼠的使用剂量为0.15 g/kg。水飞蓟素（商品名：利加隆）由德国马博士大药厂馈赠，水飞蓟素去胶囊后，使其药粉溶于蒸馏水中，制成100 g/L的混悬液，大鼠使用剂量为0.2 g/kg。高脂钆料配方为基础饲料加2%胆固醇、10%猪油、5%蔗糖和0.5%胆酸钠，由中国医学科学院实验动物研究所提供。 二、方法 (一) 实验分组Wistar大鼠自由饮水进食，饲养于18～22℃明暗各12 h的清洁级动物实验室内，正常喂养1周后，随机分为6组：（1）A组为正常对照组，用普通饲料喂养；（2）B组为模型组，用高脂饲料喂养4周制成脂肪肝模型，后继续使用高脂饲料喂养；（3）T组为硫普罗宁治疗组，用高脂饲料喂养4周制成脂肪肝模型，后改用普通饲料喂养并加用硫普罗宁治疗，每日用量为0.15 g/kg,相当于1.5 ml混悬液。（4）S组为水飞蓟素治疗组，用高脂饲料喂养4周制成脂肪肝模型，后改用普通饲料喂养并加用水飞蓟素治疗，每日用量为0.2 g/kg,相当于1.5 ml混悬液。（5）T+S组为硫普罗宁联合水飞蓟素治疗组，以上药物的混悬液；（6）N组为自然恢复组，用高脂饲料喂养4周制成脂肪肝模型，后改用普通饲料喂养。 (二) 检测方法超氧化物歧化酶(SOD)采用黄嘌呤氧化酶法，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法,严格按试剂盒说明书检测。血清甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、血清转氨酶均由我院检验科自动生化分析仪测定。 三、统计学处理 用SPSS 11.5统计软件包分析，数据用均数±标准差表示，各组之间的差别使用ANOVA分析，分析两药之间有无协同作用时使用析因分析，分析转氨酶以及氧化指标与病理积分的相关性时用Pearson相关系数，用受试者工作特征曲线(ROC)分析氧化指标、转氨酶对于脂肪肝肝功能的评估价值［2］。 结果 一、病理组织学检查 常规苏木精-伊红(HE)染色显示，A组正常组：肝小叶结构正常,中央静脉大而壁薄,肝细胞排列成肝索,在中央静脉周围呈放射状分布,细胞呈多边形。B组模型组：肝细胞中度细胞水肿,少量的肝细胞坏死,多数肝细胞内可见大小不等、数量不一的脂滴空泡(脂肪变性)。重度变性者,脂滴空泡融合,呈现中至重度脂肪变性,可见散在中性粒细胞，单核细胞等炎性细胞成团浸润，但未见明显的纤维化改变。T组硫普罗宁治疗组：肝小叶和肝血窦结构清晰,细胞排列整齐,肝细胞内无明显脂滴空泡及疏松,仅部分肝细胞呈轻度浊肿。细胞核结构清晰,核膜、核仁、核质着色正常。S组、T+S组与T组肝脏病理变化相似。N组肝小叶结构欠清晰，但较B组明显减轻，可见细胞浊肿明显，肝血窦缩小。肝细胞内可见脂滴存在，大小不等，分布不均，以腺泡3区为著，无明显中性粒细胞，单核细胞浸润。病变分布较为均一。 透射电镜结果显示，模型组大鼠可见丰富的粗面内质网以及线粒体嵴消失，电子密度增高。硫普罗宁治疗组可见完整肝细胞，胞浆内质网，线粒体，胞核，核仁基本正常。水飞蓟素治疗组可见完整的肝细胞，胞浆内内质网，线粒体，高尔基体，糖原基本正常，胞核，核仁基本正常。 二、血清生化检查 如表1所示，A组血脂与转氨酶指标在4周、8周无显著性差异，T、S、S+T组血脂水平,在4周时与A组无明显差异，8周时均明显高于A组，但低于B组，且高于本组4周时水平，转氨酶的变化同血脂变化。8周时，N组血脂较A组明显升高，较B组下降，与本组4周时相比，血脂变化不大，转氨酶出现轻度下降。析因分析显示T、S两药可起到协同降低血脂的作用，而对于降低转氨酶无协同作用。表1（略）表2（略） 三、大鼠SOD、MDA活性变化 如表2所示，阳性对照组B组肝脏组织的SOD水平明显低于正常对照组A组。各治疗组（T、S、T+S、N）SOD水平均明显高于阳性对照组B组（其中N组与B组的P<0.05）,各治疗组除S+T外，SOD水平均明显低于阴性对照组；各治疗组MDA水平均明显的高于阴性对照组，治疗组除N组MDA水平与阳性对照组无显著性差异外，余组均明显的低于阳性对照组B组；S、T两组之间无显著性差异，经析因分析统计学处理发现，S、T两种药物治疗无交互作用 四、各组病理积分 从表3可见B组大鼠的病理积分明显的高于正常组和其余各治疗组，T,S两组之间无显著性差异，但均优于N组，析因分析显示两药之间无协同作用。 五、SOD、ALT与病理积分的相关性分析 ALT与病理积分的相关系数为0.552，SOD与病理积分的相关系数0.647。表3（略）表4（略） 六、ROC分析SOD、ALT对NAFLD肝功能评估价值 如表4所示，SOD的ROC曲线下面积明显高于ALT。 讨论 本实验结果显示，经过4周高脂饲料喂养制成大鼠NAFLD模型后，继续给予高脂饲料喂养的大鼠肝脏脂肪变性、炎细胞浸润程度较各用药组严重，病理积分较同期其他各组高；其肝组织SOD水平明显低于各用药组及N组。电子显微镜可见肝细胞内线粒体结构改变嵴消失，电子密度增高。说明氧化应激在NAFLD的发病机制中起非常重要的作用。阻断氧化应激可以成为治疗脂肪肝的有效手段。 水飞蓟是菊科草本植物，主要用于中毒性肝损害、活动性肝炎、肝硬化的治疗。其药理机制为清除活性氧,对抗脂质过氧化,维持肝细胞膜的流动性。我们的研究发现水飞蓟素对于轻度NAFLD亦有预防和治疗作用。硫普罗宁是一种含有游离巯基的甘氨酸衍生物，与谷胱甘肽有相似的结构。本研究发现硫普罗宁对NAFLD亦有确切疗效。分析其作用机制为(1) 通过提供巯基，并活化超氧化物歧化酶，清除自由基，增强肝脏解毒功能，对抗各种损伤，稳定肝细胞膜和线粒体膜，可防止甘油三酯在肝内堆积，防止脂肪肝的发生，并可阻断轻度脂肪性肝炎。(2) 能降低肝细胞线粒体中ATP酶活性,使ATP含量升高,电子传递功能恢复正常,从而改善肝细胞结构和功能。 这两种药物作用机制不同，理论上两者合用可发挥更好作用，但我们的研究发现两者治疗NAFLD无合用的必要，分析其原因可能由于本模型为轻型脂肪肝，任何一种药物均可能达到较好的治疗效果；但不排除两者在肝硬化方面存在合用的必要，需要进一步研究证实。 转氨酶为反映肝细胞严重损害的指标，观察转氨酶的动态变化有助于疾病的诊断和预后判断，但是转氨酶亦存在不足之处，它的合成和清除均需一定的时间，其升高的程度与疾病的严重程度不总相符。我们的研究显示，其与病理积分的相关性较差（r=0.552）,用ROC来分析其NAFLD对肝功能的诊断价值显示ALT的诊断价值较差（AUC=0.210）,虽然SOD有一定的诊断价值，但是临床上肝脏活检较难进行。目前临床上亦有测定血液SOD等氧化指标来反映肝脏的氧化状态，但此方法容易受其他器官的影响，缺乏特异性。 参考文献 1Brunt EM. Nonalcoholic steatohepatitis:definition and pathology. Semin Liver Dis，2001,21∶3-16. 2牛华，肖质，刘莉，等.ROC曲线软件在处理不同类型资料中的应用.中国循证医学，2004，2∶132-135. 上海《肝脏》杂志社 |