非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种多病因引起的肝细胞内脂质蓄积过多的临床病理综合征，发病机制现在还有许多问题尚未阐明，但其与代谢综合征的密切关系已得到了广泛认同，而作为代谢综合征基本特征的胰岛素抵抗与NAFLD的关系亦成为当今的研究热点。虽然这方面的研究为数众多，但其确切关系仍不完全清楚。为此，本研究旨在通过高脂饮食制备大鼠NAFLD模型，探讨两者之间的关系。 材料与方法 一、动物模型制备及处理 37只雄性SpragueDawley(SD)大鼠，体重（140～160）g，购自上海西普尔必凯实验动物中心，本院实验动物中心饲养，实验动物自由进食和饮水，4只1笼饲养。适应性饲养1周后，将其随机分为模型组（27只）及对照组（10只）。模型组大鼠以高脂饲料喂养，即在普通饲料的基础上加10％猪油及2％胆固醇。对照组大鼠以普通饲料喂养。模型组大鼠在实验开始后24周（9只）、36周（10只）和48周（8只）分批处死。对照组大鼠在48周时处死。 二、标本处理 大鼠处死前隔夜禁食不禁水，处死前称量大鼠体重，腹主动脉取血后完整摘除大鼠肝脏及胰腺并称量肝脏湿重。大鼠新鲜肝脏组织及胰腺组织均以10％甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋及切片。肝脏标本分别作苏木精-伊红(HE)及Masson染色，胰腺标本HE染色，光镜下观察肝脏病变包括脂肪变、炎症及纤维化的有无及程度以及胰岛病变。大鼠血液离心分离血清，全自动生化分析仪测定血糖，放免法测定血清C肽及胰岛素（C肽及免疫活性胰岛素放射免疫测定试剂盒分别购自美国诊断试剂公司及华西糖尿病科技开发研究所）。 三、胰岛素抵抗相关指标的计算方法 通过空腹血糖（FBG）及空腹胰岛素（FINS）计算IR程度，均以HOMA模型为依据，采用如下4个公式计算：胰岛素抵抗指数（IRI）和胰岛素敏感指数（IAI）主要用于评估IR程度（胰岛素敏感性）；胰岛素分泌指数（ISI）和β细胞功能指数（HBCI）主要用于评估胰岛β细胞胰岛素分泌功能。IRI＝（FBG×FINS）/22.5；IAI＝1/（FINS×FBG）；ISI＝FINS/FBG；HBCI＝20×FINS/（FBG-3.5）。 四、统计学处理 计量资料以均数±标准差表示。组间变量比较用两样本均数t检验；计量资料各指标之间的相关性采用相关性分析。所有统计均用SPSS10.0统计软件完成。P<0.05为有统计学意义。 结果 一、一般情况 各组大鼠均生长良好，至实验结束时无大鼠死亡。各模型组大鼠体重均高于对照组大鼠，而且随着高脂时间的延长，其体重持续增长，腹部脂肪重及其与体重的比值亦呈增加趋势，肝脏湿重及肝指数均高于对照组大鼠，36及48周时最为显著（均P<0.05）（见表1）。 表1（略） 二、肝脏和胰腺病理学变化 肉眼观，对照组肝脏色泽红润。各模型组大鼠肝脏体积明显增大，包膜紧张，边缘圆钝，整个肝脏呈奶黄色，并见局灶性黄白色变性灶，切面油腻。48周模型组大鼠肝脏体积增大最为明显。 光镜下，对照组大鼠肝脏组织HE染色未见明显异常；所有模型组大鼠均出现弥漫性肝细胞脂肪变性，脂变肝细胞占全部肝细胞的2/3以上，仅中央静脉周围残存少量未脂变的肝细胞。肝细胞界限不清，肝窦狭窄。所有模型组大鼠均出现不同程度的小叶内及汇管区炎症，炎症细胞浸润以单核细胞、淋巴细胞为主，个别大鼠出现桥接坏死及碎屑坏死，各模型组之间炎症程度无显著差异。24周模型组大鼠均出现不同程度的窦周纤维化，范围均较局限，个别大鼠出现纤细的纤维间隔。36周及48周模型组大鼠纤维化程度进一步加重（见表2），部分出现桥接纤维化。 表2（略） 胰腺HE染色标本显示对照组胰腺组织基本正常，胰腺组织内散在分布多个胰岛，胰岛腺泡完整。而模型组大鼠胰岛均出现不同程度的纤维化，胰岛腺泡破坏。 三、胰岛素敏感性及胰岛素分泌功能的变化 模型组大鼠24周时血糖水平与对照组相似，36周及48周时明显高于对照组。各组空腹胰岛素水平均无明显差异。各模型组空腹C肽水平均较对照组降低，以48周时最为明显。与对照组相比，24周模型组大鼠无IR发生，而36周模型组大鼠IRI显著升高，IAI及HBCI显著降低（均P<0.05），ISI亦呈下降趋势。48周时变化趋势与36周相同（见表3）。 四、相关性分析 体重、腹部脂肪重、肝重均与IRI呈正相关，体重、肝重与IAI及HBCI呈负相关。IRI与炎症活动度计分、纤维化计分呈正相关，IAI与上述指标呈负相关，HBCI亦与炎症活动度及纤维化计分呈负相关。 讨论 NAFLD与代谢综合征（定义为至少存在以下因素中的3项：中心性肥胖、空腹血糖升高、高血压、高甘油三酯血症及高密度脂蛋白胆固醇降低）的密切关系已成为不争的事实，代谢综合征患者中NALFD的发病率甚高，代谢综合征相关因素得到改善后NAFLD亦随之改善，提示代谢综合征对NAFLD 的致病作用［1-4］。代谢综合征是如何引起NAFLD的？由于代谢综合征的共同的基本特征是胰岛素抵抗，因此胰岛素抵抗在其发病中的作用越来越受到关注。表3（略） 人们通过研究发现，几乎所有的NAFLD病人都既存在外周IR又存在肝脏IR，且肝脏病变的严重性亦与胰岛素抵抗的程度有一定相关性［5，6］。因此人们认为，IR不仅可作为首次打击引起肝细胞脂肪变性，还可作为二次打击促进NASH的发生。但是，既往对ob/ob小鼠及fa/fa Zucher糖尿病大鼠的研究发现虽然实验动物IR程度严重，但一般仅表现为单纯性脂肪肝；进一步的研究也发现在符合代谢综合征诊断标准的NAFLD患者中，其胰岛素敏感性存在明显差异，一些患者并未表现为胰岛素敏感性的下降，这就对胰岛素抵抗在NAFLD发病中为首次打击的观点提出了质疑，而且目前的研究基本都是横断面或回顾性研究，并不能确定NAFLD及胰岛素抵抗发生的先后，因此也无法确定两者的因果关系。相反的，另外一些研究发现，使用药物减轻肝细胞的脂肪沉积之后，肝脏的胰岛素抵抗也得到了改善［7，8］，这就提示在两者的关系中，NAFLD可能是胰岛素抵抗的因，而不是果。我们实验室既往的研究［9］及本实验的结果亦提供了NAFLD与胰岛素抵抗之间病因相关性的证据，虽然24周时大鼠已发生NASH，但并无胰岛素抵抗发生，这说明在本实验中，胰岛素抵抗既不是NAFLD发生的首次打击，也不是二次打击，相反地，随着NASH的进一步加重，才出现了胰岛素抵抗，这提示NAFLD可能是胰岛素抵抗的原因。 虽然本实验显示胰岛素抵抗并不参与NAFLD的发病，但是，从实验中可以看到，造模36周之后，胰岛素抵抗持续存在，而肝脏纤维化程度亦加重，提示胰岛素抵抗在促进纤维化进展方面可能具有一定作用。这与既往对NAFLD病人的研究也是一致的。对264例NAFLD患者的回顾性研究发现胰岛素抵抗是进展性肝纤维化的一个主要的、独立的危险因素［10］。 由上可见，对NAFLD患者，改善胰岛素抵抗可能是治疗的一个方面，研究发现使用二甲双胍及胰岛素增敏剂曲格列酮治疗可以降低NAFLD患者的血清转氨酶水平，但对肝脏病理的作用不确定。我们实验室既往的研究亦发现二甲双胍对高脂饮食NASH大鼠肝脏脂肪变、炎症坏死和纤维化有一定的改善作用，也支持胰岛素抵抗在NASH中的作用，但是我们也发现二甲双胍治疗组大鼠仍旧存在明显的炎症细胞浸润，单纯二甲双胍治疗并不能阻止NASH的进展［11］。结合本实验结果，我们认为在NAFLD的发病中，胰岛素抵抗虽然有一定作用，但可能并不是唯一的及始动的因素，可能是肥胖、高脂血症抑或其它因素而非胰岛素抵抗导致了NAFLD。因此，在对NAFLD患者的治疗中，还应采取针对病因如肥胖为主的综合治疗。 参考文献 1Angelico F, Del Ben M, Conti R,et al. Insulin resistance，the metabolic syndrome，and nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Endocrinol metab,2005,90∶1578-1582. 2Marchesini G, Bugianesi E, Forlani G,et al. Nonalcoholic fatty liver, steatohepatitis,and the metabolic syndrome. Hepatology, 2003，37∶917-923. 3Petersen KF, Dufour S, Befroy D,et al. Reversal of nonalcoholic hepatic steatosis, hepatic insulin resistance, and hyperglycemia by moderate weight reduction in patients with type 2 diabetes. Diabetes, 2005,54∶603-608. 4Mattar SG, Velcu LM, Rabinovitz M, et al.Surgicallyinduced weight loss significantly improves nonalcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome. Ann Surg, 2005,242∶610-620. 5Bugianesi E, Gastaldelli A, Vanni E,et al. Insulin resistance in nondiabetic patients with nonalcoholic fatty liver disease: sites and mechanisms. Diabetologia, 2005,48∶634-642. 6Pagano G, Pacini G, Musso G, et al. Nonalcoholic steatohepatitis, insulin resistance, and metabolic syndrome: further evidence for an etiologic association. Hepatology, 2002,35∶367-372. 7Samuel VT, Liu ZX, Qu XQ,et al. Mechanism of hepatic insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. J Biol Chem, 2004，279：32345-32353. 8Savage DB, Choi CS, Samuel VT,et al. Reversal of dietinduced hepatic steatosis and hepatic insulin resistance by antisense oligonucleotide inhibitors of acetylCoA carboxylases 1 and 2. J Clin Invest, 2006, 116∶817-824. 9范建高, 钟岚, 王国良, 等. 胰岛素抵抗在高脂饮食大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用. 胃肠病学, 2000, 5∶169-170. 10Bugianesi E, Manzini P, D'Antico S, et al. Relative contribution of iron burden, HFE mutations, and insulin resistance to fibrosis in nonalcoholic fatty liver. Hepatology, 2004,39∶179-187. 11丁晓东，范建高，王国良，等. 二甲双胍干预大鼠非酒精性脂肪性肝炎疗效观察. 肝脏，2005，10∶79-81. 上海《肝脏》杂志社 |