【关键词】 肝硬化； 血吸虫病； 内源性大麻素受体
The expression of cannabinoid receptor 1 in fibrotic liver tissues of mice infested with Schistosoma mansoni GAO Xiao, GUO Yan, LIU Hong-yan, TANG Wang-xian.
【Key words】 Liver cirrhosis; Schistosomiasis; Endocannabinoid receptor
【First author's address】 Institute of Liver Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Corresponding author: TANG Wang-xian, Emial: tangwx@ tjh.tjmu.edu.cn
研究发现，内源性大麻素及其相应受体在肝纤维化、肝硬化的发生发展中起重要作用。本实验旨在研究血吸虫性肝纤维化时肝组织中内源性大麻素1（CB1）受体表达的变化情况，进一步阐明血吸虫性肝纤维化发病机制，为疾病治疗开辟新的途径。
一、材料与方法
1. 实验动物：雄性昆明小鼠18只，SPF级，体重28～32g，购自湖北省疾病控制中心血吸虫病防治研究所，由我所动物房饲养。处死前12 h禁食。
2. 造模和分组：将小鼠按随机数字表随机分为2组，即正常对照组（8只）和模型组（10只），模型组小鼠用腹部敷贴尾蚴法感染血吸虫，每只小鼠25条尾蚴，敷贴5min后去除盖玻片，常规饮食饲养，至造模结束共12周。造模结束后颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取出肝组织，切取小块肝组织（厚度约0.5cm）于4%中性甲醛中固定，其余肝组织-80℃保存备用。石蜡包埋，4μm连续切片，行病理学及免疫组织化学检查，HE染色确定造模成功。
3. 免疫组织化学检查：采用SP法，操作步骤按照试剂盒说明进行，组织切片烤干，二甲苯脱蜡，乙醇透明，3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，0.1mmol/L枸橼酸钠溶液抗原修复，5% BSA封闭非特异性抗原，第一抗体浓度1∶1000孵育12h，用PBS代替第一抗体作为阴性对照，用已知阳性表达的组织作为阳性对照。结果判定：阳性细胞为胞浆着色呈黄色，先按染色强度打分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再按阳性细胞所占的百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%,2分为阳性细胞11%～50%，3分为阳性细胞51%～75%，4分为阳性细胞≥75%。计算染色强度与阳性细胞百分比二者分数的乘积，阳性程度按积分值分为：“－”≤2分，“＋”3～5分，“＋＋”6～8分，“＋＋＋”≥9分，每张切片分别从上下左右及中间观察5个不连续的高倍视野（×200），均值为该切片的积分值。
4. RT-PCR检测：肝组织用Trizol试剂一步法提取RNA，RNA纯度保持在1.8～2.0，逆转录体系为20μl：1g/L RNA模板2μl，Oligo(dt)18 1μl，5×缓冲液4μl，10mmol/L dNTP 1μl，RNA酶抑制1μl，莫罗尼鼠类白血病病毒逆转录酶1μl，焦碳酸二乙酯水10μl，42℃ 1h，95℃ 5min，产物-20℃保存。小鼠CB1上下游引物序列分别为5′-GCCTTTTGCTTGATGTGG-3′和3′-TCAAGC GTACTAGGTCGC-5′。PCR反应条件为：90℃ 5min；90℃ 50s，49℃ 30s，72℃ 50s，72℃ 5min，30个循环；产物-20℃保存。以β-actin为内参照，15g/L琼脂糖凝胶电泳，150V电泳1h，JS-380自动凝胶图像分析仪照相并分析结果。
5. Western blot检测：取-80℃冻存的肝脏组织用三去污裂解缓冲液提取蛋白，分装，-20℃保存。取等量标准化后的蛋白质溶液加入等体积的2×SDS上样缓冲液并沸水煮约10min，使蛋白质变性。再取等量变性的蛋白质溶液，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并以电转膜仪将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，经丽春红染色鉴定并标记标准蛋白位置，再以5%脱脂奶粉封闭2h，第一抗体及第二抗体孵育，DAB显色，扫描计算灰度值，以β-actin为内参照，第一抗体浓度1∶300孵育12 h以上。721分光光度计测量蛋白质浓度。
6．统计学分析：各组测定结果均以x-±s表示，所有数据用SPSS11.5进行分析，组间均数差异采用q检验。
二、结果
1. HE染色：正常组可见肝细胞形态正常，肝细胞索排列整齐。血吸虫模型组肝组织中可见虫卵结节，周围有大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，结节周围以及相邻结节之间可见胶原纤维形成，肝细胞排列紊乱（图1）。
2. 免疫组织化学结果：正常组肝组织中可见散在弱阳性表达，阳性部位位于细胞质，门静脉周围也可见少许阳性表达。模型组表达较正常组明显增多，虫卵结节周围及相邻虫卵结节之间的肝细胞质中阳性染色呈棕黄色，阳性细胞数量较正常组增多，门静脉周围阳性表达较正常组也明显增多（图2），积分值见表1。
3. RT-PCR及Western blot结果：模型组CB1受体mRNA及蛋白质表达水平均较正常组增加（图3，4），正常组和模型组mRNA表达分别水平为0.35±0.09和0.59±0.17，差异有统计学意义（t＝5.434，P<0.05）；蛋白质表达水平分别为0.21±0.11和0.63±0.21，差异有统计学意义（t＝6.189，P<0.01）。
三、讨论
CB1受体主要分布在脑、脊髓与外周神经系统中，与大麻素对记忆、认知、运动控制的调节有关，正常情况下肝脏组织中也有CB1处于低表达状态。非酒精性肝硬化时，肝脏中内源性大麻素及其相应CB受体表达均明显增加，而作用于CB1受体可以促进肝纤维化发展，使外周动脉血管舒张，促进门静脉高压的发生发展[1]，给予CB1受体阻滞剂可以降低肝脏对急性损伤的修复反应，并且可以抑制肝纤维化的发生发展，对CB1基因敲除小鼠进行研究发现，CB1受体作用受到抑制后，TGFβ1表达减少，肝组织中星状细胞活化聚集减少[2]。Batkai等[3]研究发现，胆汁淤积性肝硬化肝组织中CB1受体表达较正常情况下增加3倍，作用于CB1受体可以引起外周血管舒张，造成低血压，增加肠系膜静脉和门静脉血流量，引起门静脉高压，加重肝硬化时内毒素血症，促进肝纤维化的发展。
本实验研究血吸虫性肝纤维化时肝组织中CB1受体表达的变化情况，发现血吸虫性肝纤维化时，肝组织中CB1受体表达较正常时增加，因此我们推测，血吸虫肝纤维化时 CB1受体表达增加，内源性大麻素作用于CB1受体，促进肝纤维化发展，同时引起门静脉高压，加重内毒素血症，从而促进肝纤维化的发生发展，但其更深层次的分子生物学作用机制还有待进一步研究来阐明。我国是血吸虫病流行严重的国家，深入研究血吸虫病发病机制可以为疾病治疗提供更多的方法，已有研究表明抑制CB1受体的作用可以减轻肝硬化时内毒素血症，降低门静脉高压，抑制肝纤维化发展，其在肝脏微循环，肝细胞修复，星状细胞活化增殖等各个环节均发挥一定作用，因此提出将CB1受体作为药物作用靶点来治疗肝硬化，这为肝硬化治疗提供了新视点[4-6]，可以为疾病治疗提供新的途径。
参 考 文 献
[1]Mallat A, Lotersztajn S. Endocannabinoids as novel mediators of liver diseases. J Endocrinol Invest, 2006, 29(3 Suppl): 58-65.
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[3]Batkai S, Jarai Z, Wagner JA, et al. Endocannabinoids acting at vascular CB1 receptors mediate the vasodilated state in advanced liver cirrhosis. Nat Med, 2001, 7: 827-832.
[4]Pertwee RG. The therapeutic potential of drugs that target cannabinoid receptors or modulate the tissue levels or actions of endocannabinoids. AAPS J, 2005, 7: E625-654.
[5]Zamora-Valdes D, Ponciano-Rodriguez G, Chavez-Tapia NC, et al. The endocannabinoid system in chronic liver disease. Ann Hepatol, 2005, 4: 248-254.
[6]Gabbay E, Avraham Y, Ilan Y, et al. Endocannabinoids and liver disease--review. Liver Int, 2005, 25: 921-926.
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