【关键词】 癌，肝细胞； 转移,肿瘤； 金属蛋白酶； 小干扰RNA； c-met
A study on inhibiting hepatocellular carcinoma invasion with c-met-siRNA induced by retrovirus in vivo XIE Bin, DONG Jia-hong.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Metastasis, tumor; Metalloproteinases; RNA, small interfering; C-met
【First author's address】 Institute of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Email: xiebin313@ yahoo.com.cn
我们对c-met与肝癌的临床病理因素的关系进行了分析，明确了c-met与肝癌转移有关联[1]。此前也通过逆转录病毒载体介导，成功建立了表达c-met-siRNA的肝癌细胞株MHCC97-H/c-met-siRNA，并证实逆转录病毒载体能长期、稳定表达针对靶基因c-met的siRNA[2]，因此，本研究拟进一步在体内研究c-met-siRNA对肝癌生长、转移的影响，以期为c-met-siRNA应用于临床防治肝癌转移复发提供实验依据。
一、材料与方法
1．材料：（1）实验动物：健康纯种SPF级BALB/C 4周龄雌性和雄性裸鼠各10只，体重（20±3）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。在第三军医大学大坪医院清洁级动物实验室饲养。（2）细胞株：MHCC97-H肝癌细胞株购自复旦大学肝癌研究所；并建立含c-met-siRNA、随机序列、空载体各组细胞。
2．方法：（1）细胞准备：取对数期生长肝癌细胞株，实验前1d换液，当天用0.25%胰酶消化，培养液吹打将细胞制备成细胞悬液，1000r/min室温下离心10min，弃上清液，PBS重悬细胞，调整细胞浓度为5.0×106/ml。（2）动物分组：分别设含c-met-siRNA组(5只) 、空载体组(5只)、未转染组(5只)和随机序列组(5只)。（3）裸鼠皮下接种：4周龄雌、雄性BALB/C裸鼠共20只，消毒皮肤，无菌操作。肿瘤细胞液摇匀后，每只裸鼠皮下接种2.5×107/ml细胞悬液; 恒温、通风、无菌条件下饲养。隔日测量肿瘤大小，计算肿瘤体积=L×S2×0.5 (L：肿瘤长径；S：肿瘤短径)[3]。（4）肿瘤形成时间观察并计算抑瘤率：观察肿瘤形成时间；分别在肿瘤形成后1、7、14d测量肿瘤的长、短和裸鼠称重。在第14天时断颈处死裸鼠并称种植瘤重量，计算抑瘤率。公式为：抑瘤率(%)=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100%。(5)种植瘤组织中MMP2、MMP9的活性测定：将标本置于50mmol/L Tris-HCl缓冲液中, 加入等渗盐水和苯甲基磺酰胺使其浓度达到20mmol/L, 制成匀浆后2000×g离心1min, 取上清液制备成蛋白质抽提液。按刘煜等[4]的方法进行SDS-PAGE。凝胶经成像并以反转模式打印, 使酶解活性表现为白色背景上的黑色条带, 经图像分析系统读取条带面积和灰度。条带酶解量= 条带面积(mm2)×(条带灰度A-背景灰度A) , 以比活(比活= 酶解量÷样品蛋白浓度, 单位为Amm2?g-1?L-1) 反映酶的活性。
3. 统计学处理: 用SPSS10.0软件对各组数据进行方差分析，结果用x-±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1. c-met-siRNA对裸鼠种植性肝癌形成时间的影响：皮下注射含c-met-siRNA的转染组细胞所形成的种植瘤的时间明显延长，在未转染组、空载体组、随机序列对照组和转染组的种植瘤形成时间分别为（6.6±1.8）d、（7.2±0.8）d、（8.2±1.3）d和（17.2±2.4）d，转染组与其余组比差异有统计学意义（F值分别为43.46，94.37，18.00，P值均＜0.01）。
2. c-met-siRNA对裸鼠种植性肝癌的体积影响：在形成种植瘤的第7天，转染组细胞所形成的种植性肝癌的体积明显受到抑制，与未转染组、空载体组和随机序列组差异有统计学意义（F值分别为24.45、38.59、17.39，P值均＜0.01），见表1。表1 （略）
3. c-met-siRNA能抑制裸鼠种植性肝癌的生长：（1）c-met-siRNA能抑制种植性肝癌的生长：c-met-siRNA转染组裸鼠种植性肝癌的体积较小，呈圆形，单个。而对照各组形成的种植瘤体积较大，类圆形，表面有微血管形成。（2）各处理因素对种植性肝癌的抑瘤率：转染组、未转染组、空载体组和随机序列组的种植性肝癌质量分别为（195.2±18.6）mg、（562.4±71.2）mg、（501.jfk0±31.1）mg、（530.6±47.9）mg，抑瘤率分别为65.3%，0，10.9%，5.6%，c-met-siRNA转染组与空载体组、随机序列组相比差异有统计学意义（F值分别为66.54，132.40，33.60，P值均＜0.01）。
4．c-met-siRNA能抑制裸鼠种植瘤组织MMP2、MMP9的活性：c-met-siRNA组的MMP2（分子量6.2×104）活性显著低于其他各组(P<0.01)；MMP9（分子量8.2×104）活性显著低于其他各组(P<0.01)；而其他各组的MMP2、MMP9活性差异无统计学意义(P>0.05), 见表2。 表2 （略）
三、讨论
本实验中, 我们采用以c-met-siRNA修饰的MHCC97-H/c-met-siRNA种植裸小鼠的方法，体内观察c-met-siRNA对肿瘤生长的作用。实验结果发现肿瘤形成的时间延长，平均体积较小，呈圆形，单个。而其余3个对照组的种植瘤体积则较大，类圆形，种植瘤形成后约15d发现表面有微血管形成，可能会加速肿瘤的生长；三者之间在肿瘤大小、抑瘤率方面，无明显差异。说明以c-met-siRNA修饰MHCC97-H肝癌细胞后，能明显抑制肿瘤细胞的生长。
目前研究认为，除HGF/met外，尚有u-PA/plasmin和MMP可能与肝细胞癌的侵袭转移有关。三者既可以单独作用，又可相互影响而促进肿瘤的侵袭转移[5]。为评价c-met-siRNA与MMP的关系及其对肿瘤转移的影响，我们进一步分析了肿瘤组织中MMP的活性。MMP2、MMP9在恶性肿瘤的浸润和转移中起着重要作用。本实验采用明胶酶谱法测定了瘤组织中MMP2、MMP9的活性, 研究结果显示, c-met-siRNA组中MMP2 (6.2×104)、MMP9 (8.2×104) 的活性明显低于其他各组。本研究结果表明,c-met-siRNA可以降低与肿瘤转移有关的MMP2、MMP9 的活性，可能是其抗肿瘤转移的因素之一。
参 考 文 献
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谢斌,李晓武,董家鸿.c-met、E-钙黏蛋白、β-连环蛋白在肝细胞癌中的表达及意义.消化外科,2006,5:62-66.
[2]Xie B, Tang DG, Dong JH. Effects of c-met-siRNA on the growth and invasion of hepatocellular carcinoma MHCC97-H cells. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 499-504.
谢斌,唐德国,董家鸿.C-met-siRNA在肝癌细胞株MHCC97-H侵袭和转移中的作用.中华肝脏病杂志,2006,14:499-504.
[3]Li L, Wu PH, Huang JL, et al. Inhibitive effects of recombinant adenovirus-mediated human endostatin on the growth of human hepatocellular carcinoma xenograft in nude mice. Zhonghua Ganzangbing Zazgi, 2003, 11: 542-545.
李立，吴沛宏，黄嘉凌，等.重组人内皮抑素腺病毒抑制肝癌裸鼠移植瘤的生长.中华肝脏病杂志,2003,11:542-545.
[4]Li Y, Zhang JN, Zhu ZM. Matrix metalloproteinase zymography. Shengzhi Yixue Zazhi, 1998, 7: 111-113.
刘煜,张嘉宁,朱正美.基质金属蛋白酶酶谱分析法.生殖医学杂志,1998,7:111-113.
[5]Schoedel KE, Tyner VZ, Kim TH, et al. HGF, MET, and matrix-related proteases in hepatocellular carcinoma, fibrolamellar variant, cirrhotic and normal liver. Mod Pathol, 2003, 16: 14-21.
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