【摘要】 目的 探讨新生大鼠肝细胞脾内移植联合重组鼠肝再生增强因子（rALR）治疗大鼠急性肝衰竭的疗效与免疫学机制。 方法 采用D-氨基半乳糖（1.2g/kg）诱导并建立大鼠急性肝衰竭模型，36h后随机分为6组：Ⅰ组：模型对照组；Ⅱ组：经脾脏注射等渗盐水1ml，腹腔注射等渗盐水1ml/d；Ⅲ组：经脾脏注射rALR 1ml（50μg/kg），腹腔注射rALR 1ml（50μg?kg-1?d-1）；Ⅳ：经脾脏移植2×107同种异体新生大鼠肝细胞，腹腔注射等渗盐水1ml/d；Ⅴ组：经脾脏移植2×107同种异体新生大鼠肝细胞，腹腔注射rALR 1ml（50μg?kg-1?d-1）；Ⅵ组：经脾脏移植2×107同种异体新生大鼠肝细胞，腹腔注射环孢菌素1ml（10mg?kg-1?d-1）。观察大鼠每天存活率；术后第1、5天及2周处死大鼠以获取肝、脾组织，观察脾内移植肝细胞的组织学改变；在术前、术后第1、2、5、12天采集静脉血，采用放射免疫法测定血清IL-1β和TNFα的浓度。 结果 Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组大鼠存活时间差异无统计学意义，Ⅳ组有部分大鼠长期存活，2周存活率为33%，Ⅴ组大鼠2周存活率显著高于Ⅳ组，而与Ⅵ组大鼠2周存活率比较差异无统计学意义。Ⅳ、Ⅵ组脾内移植的肝细胞可存活5～7d，Ⅴ组脾内移植肝细胞可存活至2周以上。术后第1天，Ⅳ组血清IL-1β水平显著高于Ⅴ组和Ⅵ组（P＜0.05）；术后第5天，Ⅳ组血清IL-1β水平仅与Ⅵ组差异有统计学意义（P＜0.05）。术后第1天，TNFα的浓度在Ⅱ组显著高于Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组（P＜0.05）。 结论 新生大鼠肝细胞脾内移植与rALR联合治疗大鼠急性肝衰竭有一定疗效,可提高D-氨基半乳糖诱导肝衰竭大鼠的存活率；移植肝细胞在脾脏可存活2周以上，其机制可能与促进肝细胞再生、预防移植肝细胞凋亡及轻微抑制细胞免疫有关。
【关键词】 大鼠； 肝功能衰竭，急性； 肝细胞； 肝再生增强因子
Intrasplenic transplantation of newborn rat hepatocytes with rALR for treating rats with acute hepatic failure CHEN Yao, YUAN Gang, SUN Hang, LIU Qi. Institute for Viral Hepatitis, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China
Corresponding author: LIU Qi, Email: liuqiz@ hotmail.com
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of newborn rat hepatocyte intrasplenic transplantation combined with rat augmenter of liver regeneration (rALR) injection in treating rats with acute hepatic failure. Methods Acute hepatic failure (AHF) was induced in rats using D-gal (1.2 g/kg). The rats were then randomly divided into 6 groups. Group I received no further treatment and served as blank controls; group II received 1ml uffered saline once through intrasplenic injection; group III received 1 ml rALR; group IV received 2×107/ml hepatocytes; group V received 2×107 hepatocytes suspended in 1 ml rALR (50μg/kg) and group VI received 2×107 hepatocytes in 1ml cyclosporine A (10 mg/kg). The rats of the various treated groups were sacrificed at day 1, 5 and at week 2 and their livers and spleens were examined histopathologically. Blood samples of the rats were also obtained to determine the levels of TNFα and IL-1β. Results There were no significant differences in survival between group I, II and III rats. 33.3% of the group IV rats survived for 2 weeks. At week 2, the survival rate of group V rats was significantly higher than that of group IV, but there was of no statistical significant increase when compared to that of group VI rats. Hepatocytes transplanted into spleens survived for 5-7 days in the spleens of group IV and VI rats, but they survived at least 2 weeks in group V. The average serum TNFα level in group IV was significantly higher than that in groups V and VI on the first postoperative day, but after four days, only the difference between group IV and group VI was significant (P < 0.05). The average serum level of TNFα in group II was higher than that in groups IV, V and VI on the first postoperative day (P < 0.05), but there were no sigificant differences between those in groups IV, V and VI on the 1st and the 5th postoperative days. Conclusion Newborn rat hepatocyte intrasplenic transplantation combined with rALR is effective in treating acute hepatic function failure induced by D-gal in rats. The transplanted hepatocytes can survive for at least 2 weeks in the spleens. The rALR mixed with the hepatocytes injected into the spleens may be able to facilitate the hepatocyte regeneration, to inhibit liver cell apoptosis and to suppress the cellular immunity.
【Key words】 Rats; Liver failure, acute; Hepatocyte; Augmenter of liver regeneration
异体肝脏移植是对急性肝衰竭和终末期肝脏疾病治疗的有效措施，然而由于其受供体缺乏、需要长期的免疫抑制治疗等因素的影响而受到严重限制。而肝细胞移植治疗有较多优点[1]，因而受到广泛重视。但由于移植肝细胞数量较少，不能完全有效地代偿严重受损的肝功能；移植肝细胞为同种异体，基因型不同，易受排斥反应影响，因此肝细胞移植在临床应用的有效性仍受到广泛质疑[2]。许多研究已证实肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration，ALR）在体内除可直接刺激肝细胞增殖外，还参与了复杂的免疫调节，能有效抑制TNFα等阻碍肝细胞再生的免疫因子[3，4]。我们采用D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭,移植富含ALR的新生大鼠肝细胞治疗急性肝衰竭大鼠,观察不同处理组肝衰竭大鼠存活率及IL-1β、TNFα和增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）表达水平的变化，为临床开展肝细胞移植联合ALR治疗重型肝炎提供实验依据。
材料与方法
1. 动物与试剂：Wistar大鼠雌雄各半,体重150～250g；0～24h龄新生Wistar大鼠，均由重庆医科大学动物中心提供。D-氨基半乳糖购于重庆医科大学化学教研室。检测血清IL-1β、TNFα浓度的放射免疫试剂盒购于中国东亚试剂公司。小鼠抗大鼠PCNA抗体及DAB显色试剂盒购于北京中杉公司。重组大鼠肝再生增强因子（rALR）由本研究所制备。
2. 急性肝衰竭模型的建立：在预实验中经大鼠脾内注射不同剂量(1.0、1.2、1.4、1.4g/kg) 的D-氨基半乳糖，根据动物死亡率、肝脏病理改变及肝功能损害情况选择大鼠急性肝衰竭的最适诱导剂量为1.2g/kg。Wistar大鼠94只，雌雄各半，于腹腔内一次性注射浓度为1.2g/kg的D-氨基半乳糖，建立大鼠急性肝衰竭模型。
3. 新生大鼠肝细胞制备：参照文献[5]的方法制备新生大鼠肝细胞，用DMEM将细胞浓度调至2×107/ml备用。
4. 实验分组及处理：所有造模大鼠于造模后36h随机分为6组：Ⅰ组为模型组（n＝14）；Ⅱ组（n＝14）：脾内注射等渗盐水1ml，以后每天腹腔注射等渗盐水1ml；Ⅲ组（n＝16）:脾内注射含50μg/kg rALR的等渗盐水1ml，以后每天腹腔注射含相同剂量rALR的等渗盐水1ml；Ⅳ组（n＝18）：脾内注射含2×107个新生大鼠肝细胞的等渗盐水1ml，以后每天腹腔注射等渗盐水1ml；Ⅴ组（n＝16）：脾内注射1ml含50μg/kg rALR和2×107个肝细胞的等渗盐水，以后每天腹腔注射含相同剂量rALR的等渗盐水1ml；Ⅵ（n＝16）：脾内注射1ml含10mg/kg环孢菌素和2×107个肝细胞的等渗盐水，以后每天腹腔注射含相同剂量环孢菌素的等渗盐水1ml。
5. 手术处理：所有造模大鼠都行开腹手术以暴露脾脏。手术过程：用异戊巴比妥钠（50ml/kg）腹腔注射，麻醉后固定于操作台，腹部去毛、消毒、铺孔巾，上腹切口开腹，止血钳止血。移开胃及网膜找到脾脏，无齿弯形镊将脾脏拉出置于孔巾上, 无齿止血钳阻断脾门部。根据不同分组，用注射器从脾尾向脾实质内缓慢注射相应治疗药物。棉签轻压注射孔，确定无出血后取掉脾门部止血钳,将脾脏放回腹腔，逐层缝合关腹。每只大鼠于手术当天及以后每天常规肌肉注射青霉素0.2MU。
6. 一般情况观察：观察大鼠的精神、饮食、反应、小便、皮毛等情况。
7. IL-1β和TNFα的检测：各组动物分别在术前、术后1、2、5、12d采集静脉血，分离血清，采用放射免疫法测定大鼠血清IL-1β和TNFα的浓度。
8. 组织学检查：分别于术后1d、5d、2周取大鼠肝脏、脾脏标本,进行常规病理学检查及用免疫组织化学方法检测不同处理组肝组织中PCNA的表达。
9. 统计学分析：所有计量资料以x-±s表示, IL-1β、TNFα水平采用多个样本均数间两两比较的q检验,用SPSS11.0软件进行统计学分析。
结 果
1. 不同处理组大鼠的一般情况：大鼠在药物诱导后24～36h，精神反应明显亢奋，多汗，脚掌及皮肤毛色泛黄，小便浓呈深黄色改变，食欲明显下降；第40小时开始逐渐进入昏迷状态，模型对照组大鼠死亡时间大多在造模后48～72h，最长存活时间为造模后88h。Ⅱ、Ⅲ组大鼠术后精神食欲无好转，逐渐死亡；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的部分大鼠上述情况明显好转，精神食欲及活动能力逐渐恢复正常，能存活2周以上的时间。见图1（略）。
2. 血清IL-1β、TNFα浓度的检测: 结果显示术后1d，Ⅳ～Ⅵ组与Ⅱ组比较血清TNFα水平明显下降（P<0.05），而Ⅳ～Ⅵ组各组间差异无统计学意义；术后5d，Ⅳ～Ⅵ组血清TNFα水平虽有所上升,但各组前后比较差异无统计学意义。在术后1d，IL-1β水平在Ⅳ组较Ⅴ、Ⅵ组明显上升，在术后5d，Ⅵ组与Ⅳ组比较差异有统计学意义；术后第5天, Ⅳ组IL-1β的水平较前有所下降，而Ⅴ、Ⅵ组有上升趋势，但各组前后比较差异无统计学意义。见表1。
3. 组织学改变:模型组大鼠脾脏形态（图2略）。Ⅳ组在移植后1～2d脾内见大量完整肝细胞,分布于红髓中,白髓边缘多见,部分肝细胞变性坏死（图3略）；第4～5天移植细胞周围出现大量炎性细胞浸润,肝细胞数量明显减少（图4略）；移植后1周移植细胞很少见到。Ⅵ组的改变基本相同，相比而言，光学显微镜下该组脾内肝细胞于第4～5天肝细胞的变性坏死较轻（图5略）。Ⅴ组较Ⅳ、Ⅵ组脾内肝细胞变性坏死更少,术后5d见少量炎性细胞浸润,移植后2周仍可见散在的肝细胞（图6略）。
4. PCNA的表达：因肝衰竭而死亡的大鼠肝脏有大量炎性细胞浸润，且这些炎性细胞大量表达PCNA，只有极个别肝细胞表达PCNA。Ⅴ组大鼠术后2周肝脏组织结构已基本恢复，肝细胞大量表达PCNA，并沿中央静脉分布（图7略）。
讨 论
本研究中，我们采用的药物性大鼠肝衰竭模型能较好地模拟人体病情,较接近于临床移植中供体、受体实际情况。在肝细胞移植部位的研究中发现，脾内移植较肝内及腹腔移植能更好地降低并发症及免疫排斥反应的风险[6]。我们通过肝细胞脾内移植方式,能更好地在脾内分辨出移植肝细胞及了解移植肝细胞的存活状态，采用2×107个细胞数进行脾内肝细胞移植，结果证明有效。
不同肝细胞的增殖和分化能力不同，成年哺乳动物肝细胞增殖能力最差，新生动物肝细胞增殖能力最强，胎肝细胞增殖能力居中[7]。由于新生大鼠肝细胞增殖能力最强，能自分泌rALR，且抗原性较成年大鼠肝细胞弱，故我们采用新生大鼠肝细胞作为移植的供体。通过初步对Ⅰ～Ⅳ组的2周存活率比较发现，Ⅳ组的2周存活率达到33%（6/18），与Ⅱ（0/14）、Ⅲ组（0/16）和Ⅰ组（0/14）比较差异有统计学意义。此结果体现了移植新生大鼠肝细胞在受体体内能较好地支持药物性暴发型肝衰竭大鼠肝功能的作用。在进一步的实验研究中，通过各组2周存活率的比较可以看出，在加用rALR后，能更好地治疗药物所致的肝衰竭大鼠，并明显地提高肝衰竭大鼠的2周存活率。但同时我们也发现若单纯应用rALR（Ⅲ组）治疗，肝衰竭大鼠无一存活（0/16），表明rALR可能只是在新生大鼠肝细胞移植的基础上起到直接刺激肝细胞增殖及抑制免疫反应，减少免疫排斥反应的发生，利于移植细胞存活的作用，也从另一方面再次证实了新生大鼠肝细胞在药物性肝衰竭大鼠体内起到肝功能支持的作用。
从组织学改变来看，肝细胞移植+rALR组较Ⅳ、Ⅵ组的脾内肝细胞变性坏死更少；移植后2周仍可见散在的肝细胞在脾内存留，而Ⅳ、Ⅵ组于1周后脾内未能发现完整肝细胞。从血清TNFα水平比较发现：在肝细胞移植治疗后，其浓度有明显下降，各肝细胞移植组间无明显差异，提示经肝细胞移植治疗后，可降低肝衰竭大鼠因药物性肝损伤所引起的TNFα浓度升高。本研究结果提示，移植新生大鼠肝细胞在早期可能通过成年大鼠肝细胞的某种尚不知道的方式来调节肝衰竭大鼠体内的细胞因子水平，但是否通过其有效地分泌rALR或其他因子，还需要进一步的研究。随术后时间的延长，TNFα的水平呈上升趋势，可以推论细胞免疫的发生较为延迟，结合组织学表现，其术后第2～5天应为高峰，此时不仅各实验组大鼠死亡严重，而且组织学观察到Ⅳ组、Ⅵ组大鼠脾内的肝细胞大量减少，至第7天基本不能见到。IL-1β血清水平的变化情况也应证了TNFα因子在其体内的变化趋势，体现了TNFα是IL-1β的主要刺激因子。
综合组织学改变及血清IL-1β、TNFα浓度变化情况，Ⅴ组、Ⅵ组经应用rALR、环孢菌素后有一定的免疫调节或抑制作用，可能由于连续应用rALR后起到了直接促进移植肝细胞在体内增殖的作用，使得出现了最好的治疗效果。虽然本研究的结果表明新生大鼠肝细胞脾内移植与rALR联合治疗大鼠急性肝衰竭有很好的疗效，但由于rALR在体内多种组织中有表达，肝衰竭时这些组织中rALR有什么变化？外源性、大剂量、长时间补充对这些表达rALR组织的功能有何影响都需要进一步的研究阐明。
参 考 文 献
[1]Strom S, Fisher R. Hepatocyte transplantation: new possibilities for therapy. Gastroenterology, 2003, 24: 568-571.
[2]Eguchi S, Lilja H, Hewitt WR, et al. Loss and recovery of liver regeneration in rats with fulminant hepatic failure. J Surg Res, 1997, 72: 112-122.
[3]Tanigawa K, Sakaida I, Masuhara M, et al. Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J Gastroenterol, 2000, 35: 112-119.
[4]Adams GA, Maestri M, Squiers EC, et al. Augmenter of liver regeneration enhances the success rate of fetal pancreas transplantation in rodents. Transplantation, 1998, 65: 32-36.
[5]Liu Q, Yuan G. An improved method of isolation and purification for newborn rat's hepatocytes and the study for preservation and revivfication. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2004, 12: 53-54.
刘杞,袁刚.新生大鼠肝细胞的分离纯化及冻存条件分析.中华肝脏病杂志,2004,12:53-54.
[6]Fisher RA, Strom SC. Human hepatocyte transplantation: worldwide results. Transplantation, 2006, 82: 441-449.
[7]Jauregui HO. Treatment of hepatic insufficiency based on cellular therapies. Int J Artif Organs, 1991, 14: 321-326.
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