【摘要】目的研究金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）在活化肝星状细胞（HSCs）中的表达，观察其对细胞外基质（ECM）合成分泌的影响。方法原代分离培养大鼠HSCs活化后，分别给予40～160 pmol化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA进行干预，检测培养细胞上清液透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）和羟脯氨酸（Hyp）的含量，采用荧光实时定量PCR法检测TIMP-2、MMP-2、MT1-MMP、MMP-13、COL Ⅰ和COL Ⅲ mRNA的表达，western印迹检测TIMP-2、MT1-MMP和MMP-13蛋白表达及明胶酶谱法检测MMP-2蛋白表达。结果应用化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA后，TIMP-2、MMP-2、MT1-MMP、COL Ⅰ和COL Ⅲ的表达明显降低，而MMP-13的表达则明显增加，培养细胞上清液中HA、PCⅢ和Hyp的含量也明显减少。结论TIMP-2通过MT1-MMP介导MMP-2的活化，抑制TIMP-2的表达，MT1-MMP和MMP-2的表达随之降低，而HSCs合成分泌ECM也相应减少。 【关键词】金属蛋白酶组织抑制剂2； 基质金属蛋白酶-2； 膜型基质金属蛋白酶-1； 肝星状细胞； 细胞外基质； RNA干扰 Expressions of TIMP-2, MMP-2 and MT1-MMP in activated hepatic stellate cells and their effects on the synthesis and secretion of extracellular matrixHU Yingbin, LI Dingguo, ZHANG Wenzhu, et al.Department of Digestive Diseases, Affiliated Xinhua Hospital, Medical School of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, China 【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship among tissue inhibitors of metalloproteinase2 (TIMP-2), matrix metalloproteinase2(MMP-2) and membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) and study their effects on the synthesis and secretion of extracellular matrix (ECM). MethodsHSCs were isolated from SpragueDawley rats by collagenase and pronase E perfusion of liver from through portal vein and by 12% Nycodenz gradient centrifugation. After activation of HSCs, HSCs were treated with the quantity ranging from 40 pmol to 160 pmol of chemically modified small interfering RNA (siRNA) targeting TIMP-2. The levels of hyaluronic acid (HA), procolagen type III (PCIII) and hydroxyproline (Hyp) in supernatant were measured. Expressions of TIMP-2 mRNA, MMP-2 mRNA, MT1-MMP mRNA, MMP-13 mRNA, COL I mRNA and COL III mRNA were detected by quantitative realtime PCR. Protein levels of TIMP-2, MT1-MMP and MMP-13 were evaluated by western blotting, and the content of MMP-2 was examined by gelatin zymography. ResultsThe levels of HA, PCIII and Hyp in three groups treated with siRMA was decreased markedly compared with that in normal group. The expression of TIMP-2, MMP-2, MT1-MMP , COL I and COL III in three treated groups were significantly lower than that in normal group, but the expression of MMP-13 was significantly higher than that in normal group. ConclusionTIMP-2 mediated by MT1-MMP regulated MMP-2 activation. The siRNA targeting TIMP-2 reduces the expression of TIMP-2, which associated with downregulation of MT1-MMP and MMP-2, could suppress the synthesis and secretion of ECM in activated HSCs. 【Key words】Tissue inhibitors of metalloproteinases2; Matrix metalloproteinases; Membrane type 1 matrix metalloproteinases; Hepatic stellate cells; Extracellular matrix; Small interfering RNA 肝星状细胞（HSCs）在肝纤维化时被激活转化为肌成纤维样细胞，是产生细胞外基质（ECM）的主要细胞，而基质金属蛋白酶（MMPs）及其金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）是调节ECM的主要酶，因此研究它们在HSCs中的表达及作用机制，有利于从ECM合成与降解失衡这一肝纤维化发展的最终环节入手寻找新的治疗策略。 近年发现活化的HSCs既能合成分泌MMP-2，也能合成分泌MMP-2的调节因子膜型基质金属蛋白酶-1（membrane type 1 matrix metalloproteinase，MT-MMP）和TIMP-2［1］，但三者之间的关系及其对ECM合成的影响尚不清楚。本研究通过化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA抑制TIMP-2的表达，探讨TIMP-2、MMP-2和MT1-MMP三者之间的关系，明确其对HSCs合成分泌ECM的影响。 材料与方法 一、材料 雄性SD大鼠，体重450～500 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。化学合成经修饰抗-TIMP-2 siRNA由美国Invitrogen Life Technologies公司设计合成。抗-TIMP-2 siRNA正义链：5′-GCCAAGUUCUUUGCCUGCAUCAAGA-3′；反义链：5′- UCUUGAUGCAGGCAAAGAACUUGGC-3′。 抗TIMP-2 siRNA阴性对照正义链：5′-GCCUUGUUCCGUGUCUACACAAAGA-3′；反义链：5′-UCUUUGUGUAGACACGGAACAAGGC-3′。 脂质体 2000、预制酶谱法明胶(Novex Zymogram Gels)、复性缓冲液（Zymogram Renaturing Buffering）和显色缓冲液（Zymogram Developing Buffering）购自美国Invitrogen Life Technologies公司。定量RTPCR试剂盒（ExScript RTPCR Kit）购自大连TaKaRa公司。RNA抽提试剂Trizol由上海生工公司提供。结蛋白抗体、β肌动蛋白抗体和TIMP-2抗体购自武汉博士德公司。抗α平滑肌肌动蛋白（αSMA）、密度梯度离心剂(Nycodenz)、链酶蛋白酶E、Ⅳ型胶原酶购自美国SigmaAldrich公司。辣根酶标记第二抗体购自美国Santa Cruz公司。SuperSignal West Pico化学发光底物购自美国Pierce Biotechnology公司。透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）放射免疫分析试剂盒购自上海海研医学生物技术有限公司。羟脯氨酸（Hyp）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。DMEM干粉培养基购自美国Gibco公司。胎牛血清(FBS)购自兰州民海生物工程有限公司。 二、方法 (一) 原代HSCs分离培养 经腹腔内注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠后，门静脉插入静脉留置针，以胶原酶和链酶蛋白酶E原位灌流消化肝脏。分离细胞悬液以12% Nycodenz梯度离心（1 500 g，17 min）,于梯度界面获取HSCs,以含10% FBS的DMEM培养基将细胞接种于无包被塑料培养板和培养瓶中。以锥虫蓝染色法鉴定细胞活力，相差显微镜观察细胞形态，荧光显微镜观察自发荧光。新鲜分离的HSC纯度和细胞活力均大于90%。 (二) 免疫细胞组织化学检测细胞结蛋白和α-SMA鉴定HSCs 细胞经95%乙醇固定后，加适量过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，先后加入特异性第一抗体和相对应的第二抗体，最后经二氨基联苯胺显色，苏木精复染。 (三) 细胞分组及处理 活化HSCs贴壁70%时，用胰酶消化后以1×106/ml接种于6孔板中，在脂质体2000转染前24 h换无血清培养基。细胞分为5组：细胞培养组；阴性对照组，每孔予80 pmol阴性对照siRNA和脂质体2000 4 μl；siRMNA1组、siRNA2组和siRNA3组，每孔分别给予40 pmol、80 pmol和160 pmol 抗TIMP-2 siRNA及对应脂质体2000（2 μl、4 μl和8 μl）。置37℃，体积分数为5%CO2培养箱中孵育，48 h后收集细胞及培养上清液以备后续实验。 (四) 培养细胞上清液HA、PCⅢ和Hyp的检测 取转染后培养细胞上清液，按试剂盒说明采用放射免疫法检测HA和PCⅢ，采用样本碱水解法检测Hyp。 (五) 荧光实时定量PCR 用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度。按定量RTPCR试剂盒说明书取1 μg总RNA逆转录合成cDNA，然后以Sybr Green染料作为荧光标记物，在LightCycler荧光实时定量PCR仪（Roche公司，德国）上进行PCR反应。PCR引物：TIMP-2正义链，5′- ACCCAGAAGAAGAGCCTAAACCA-3′， TIMP-2反义链，5′-GTCCATCCAGAGGCACTCATC-3′；MMP-2正义链，5′- CTGGAGAACCAAAGTCTCAAGAGC-3’,MMP-2反义链，5’-GTTAACTACAGAGGAGGACAGAGC-3’；MT1-MMP正义链，5’-GCAGCGGAGCCGTGAGT-3’， MT1-MMP反义链，5’-GTGTCCCATGGCGTCTAAAGA-3’； MMP-13正义链，5’- AGAGGTGAAAAGGCTCAGTGCT-3’， MMP-13反义链，5’-GTCTTCCCCGTGTCCTCAAA-3’；Ⅰ型胶原纤维（COL Ⅰ）正义链，5’-GAGGGCGAGTGCTGTCCTT-3’, CoL Ⅰ反义链，5’-GGTCCCTCGACTCCTATGACTTC-3’； Ⅲ型胶原纤维（COL Ⅲ）正义链，5’TGAAGGAAATAGCAAATTCACTTACAC-3’，COL Ⅲ反义链，5’TCAAAGACTGTCTTGCTCCATTC3’；3’磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase，GAPDH）正义链，5’-GCATGGCCTTCCGTGTTCCTACC-3′， 3′-磷酸甘油醛脱氢酶反义链，5′GCCGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′。反应条件如下：预变性 95℃ 10 s；30个循环中95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 5 s。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，使用正常SD大鼠肝组织制作外在标准曲线，并用双标准曲线法进行相对定量，即特异性基因表达量/管家基因表达量（GAPDH）。 (六) Western印迹检测TIMP-2、MT1-MMP和MMP-13蛋白表达 细胞上清液浓缩后（TIMP-2和MMP-13）或细胞（MT1-MMP）经裂解液提取蛋白，采用BCA法定量蛋白浓度。蛋白加热变性后在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后采用半干法将凝胶中蛋白电转印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，用5%的脱脂奶粉封闭后，先后加入特异性第一抗体和相对应的第二抗体，最后经化学发光法在X片上显影并扫描结果条带，测定光密度值。采用特异性基因光密度/管家基因光密度（βactin）相对定量。 (七) 明胶酶谱法检测MMP-2蛋白表达 细胞上清液浓缩后，在Novex Zymogram Gels胶中进行非变性电泳，复性缓冲液室温轻摇30 min后倾去，显色缓冲液平衡30 min，然后显色缓冲液37℃过夜，0.1%考马斯亮蓝染色，脱色，拍照。 三、统计学分析 应用SAS 6.12软件包进行统计分析，数据以±s表示，组间差异使用方差分析，两两比较采用StudentNewmanKewls法，以P＜0.05表示有统计学差异。 结果 一、HSCs形态观察及鉴定 刚分离的HSCs呈圆形，胞浆内有折光性强的颗粒，荧光显微镜下可见蓝绿色激发荧光，经结蛋白染色鉴定细胞性质，5 d后HSCs开始活化，胞体向外伸展，呈星形状，培养10 d左右HSCs活化为具有成纤维细胞外型，经αSMA染色鉴定细胞性质（见图1略）。 二、各组HSCs培养上清液中HA、PCⅢ和Hyp的含量 如表1所示，各siRNA干预组HA、PCⅢ和Hyp含量均显著低于细胞培养组（P＜0.05），且PCⅢ和Hyp含量在各siRNA干预组之间的比较差异有显著性（P＜0.05）。表1(略) 三、TIMP-2、MMP-2、MT1-MMP、MMP-13、COL Ⅰ和COL Ⅲ mRNA的表达 如表2所示，各siRNA干预组TIMP-2、MMP-2、COL Ⅰ和COL Ⅲ mRNA表达均显著低于细胞培养组（P＜0.05），且各siRNA组之间比较差异有显著性（P＜0.05）；仅siRNA-2组和siRNA-3组MT1-MMP mRNA的表达明显低于细胞培养组（P＜0.05）；各siRNA干预组MMP-13 mRNA表达均显著高于细胞培养组（P＜0.05），且各siRNA干预组之间比较差异有显著性（P＜0.05）。 四、TIMP-2、MT1-MMP、MMP-13和MMP-2蛋白的表达 如表3所示，各siRNA干预组TIMP-2和MMP-2蛋白表达均显著低于细胞培养组（P＜0.05），且各siRNA组之间比较差异有显著性（P＜0.05）； siRNA2组和siRNA3组MT1-MMP蛋白表达均显著低于细胞培养组（P＜0.05）；各siRNA干预组MMP-13蛋白表达均显著高于细胞培养组（P＜0.05），且各siRNA组之间比较差异有显著性（P＜0.05）。 表2（略）表3（略） 讨论 siRNA是RNA干扰过程中的效应分子，能够高效特异性地沉默同源性靶mRNA的表达，从而达到基因沉默的目的。然而普通标准的siRNA也存在一些不足，如脱靶效应、非特异性效果以及不稳定性［2，3］。为了解决这些问题，本研究采用化学合成经修饰抗TIMP-2 siRNA进行干预实验，证明能够高效抑制TIMP-2基因和蛋白的表达，且不同浓度组之间存在显著差异。 我们发现活化的HSC可以分泌产生TIMP-2、MMP-2和MT1-MMP，这与以往研究相一致［4］。在给予不同浓度抗TIMP-2 siRNA干预后，MMP-2和MT1-MMP的表达均明显降低，且有一定的剂量效应关系。目前3D晶体结构已经证实TIMP-2，MMP-2和MT1-MMP三者之间的结合位点［5］。进一步的研究则发现MMP-2的活化与TIMP-2和MT1-MMP密切相关，即首先是细胞膜上激活的MT1-MMP与TIMP-2的N末端结合，然后MT1-MMP通过各自的血红素结构域相互靠拢形成二聚体或多聚体，接着proMMP-2与TIMP-2的C末端结合，MT1-MMP剪切proMMP-2的诱饵蛋白激活MMP-2，最后MMP-2从复合体中解离而发挥生物学活性［6-8］。因此抑制TIMP-2的表达将阻止MMP-2的活化。激活的MMP-2通过降解基底膜以及氧应激途径，促进炎症细胞的侵袭和HSCs的活化，后者合成分泌ECM增加，反过来又促进MMP-2的表达，这样就形成了一个正反馈恶性循环［9-11］。如果能终止这种恶性循环的起始环节，那么将有效抑制HSCs的活化，减少ECM合成分泌。我们在各siRNA干预组中发现， 一方面MMP-2和MT1-MMP的表达量随TIMP-2的表达减少而下降，另一方面 MMP-13的表达量则随TIMP-2的表达减少而上升，这与COL Ⅰ和COL Ⅲ的表达显著减低相一致。此外，应用抗TIMP-2 siRNA干预后，培养细胞上清液中HA、PCⅢ和Hyp的含量也明显减少。这充分证明了MMP-13降解ECM能力增强，而 MMP-2致纤维化作用减弱，最终ECM合成分泌减少。总之，TIMP-2通过MT1-MMP介导MMP-2的活化，它们三者之间的关系直接影响到HSCs合成分泌ECM，抑制TIMP-2的表达，并将减少ECM的沉积。 参考文献 1Benyon RC, Hovell CJ, Da Gaca M, et al. Progelatinase A is produced and activated by rat hepatic stellate cells and promotes their proliferation. Hepatology, 1999, 30∶977-986. 2Bridge AJ, Pebernard S, Ducraux A, et al. Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat Genet, 2003, 34∶263-264. 3Persengiev SP, Zhu X, Green MR. Nonspecific, concentrationdependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA, 2004, 10∶12-18. 4Wang DR, Sato M, Sato T, et al. Regulation of matrix metalloproteinase expression by extracellular matrix components in cultured hepatic stellate cells. Comp Hepatol, 2004, 14(Suppl 1)∶S20. 5FernandezCatalan C, Bode W, Huber R, et al. Crystal structure of the complex formed by the membrane type 1matrix metalloproteinase with the tissue inhibitor of metalloproteinases2, the soluble progelatinase A receptor. EMBO J, 1998, 17∶5238-5248. 6Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res, 2003, 92∶827-839. 7Butler GS, Butler MJ, Atkinson SJ, et al. The TIMP2 membrane type 1 metalloproteinase “receptor” regulates the concentration and efficient activation of progelatinase A. A kinetic study. J Biol Chem, 1998, 273∶871-880. 8Morgunova E, Tuuttila A, Bergmann U, et al. Structural insight into the complex formation of latent matrix metalloproteinase 2 with tissue inhibitor of metalloproteinase 2. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99∶7414-7419. 9Galli A, SvegliatiBaroni G, Ceni E, et al. Oxidative stress stimulates proliferation and invasiveness of hepatic stellate cells via a MMP2mediated mechanism. Hepatology, 2005, 41∶1074-1084. 10Theret N, Lehti K, Musso O, et al. MMP2 activation by collagen I and concanavalin A in cultured human hepatic stellate cells. Hepatology, 1999, 30∶462-468. 11Wang DR, Sato M, Li LN, et al. 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