【摘要】目的观察粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）表达质粒体内转染对小鼠髓源性树突状细胞（DC）前体的诱导作用，为探索乙型肝炎新的免疫治疗提供研究基础。方法30只BALB/c小鼠随机分为对照组、100 μg剂量组和200 μg剂量组，注射1周，分离骨骼肌，抽提RNA，利用RT-PCR观察反转录水平；分离小鼠骨髓细胞，并以重组小鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)诱导培养DC,倒置显微镜下观察其形态, 并做扫描电镜检测。ELISA法检测小鼠血清中的GM-CSF表达量，流式细胞仪检测其表面分子(CD80,CD86,MHC-Ⅱ,CD11c)表达情况。结果体内转染后，ELISA检测血清中GM-CSF表达量，与对照组比较,100 μg组和200 μg组表达量均有明显升高（P<0.01）；流式细胞仪检测显示 100 μg组和200 μg组CD11c和MHC-Ⅱ类分子表达较对照组明显升高(P<0.01），CD80和CD86有所升高（P<0.05）。 结论GM-CSF质粒体内注射可以明显刺激诱导小鼠髓源性DC前体的增殖，增强DC的抗原提呈作用。 【关键词】粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子； 树突状细胞； 体内诱导 Study of the inducing effects of GM-CSF plasmid on preDC from murine bone marrow in vivoHU Weiwei, ZANG Guoqing, YU Yongsheng, et al.Department of Infectious Disease,Sixth Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233，China 【Abstract】ObjectiveTo investigate the inducing effects in vivo of the transfection of GM-CSF plasmid on murine marrow preDC in order to explore some basis for new immune treatment of chronic hepatitis B. Methods30 BALB/c mice were randomly divided into three groups:normal control group, 100 μg group and 200 μg GM-CSF plasmid group. One week after infection,mice were killed, RNA extracted from skeletal and muscle,level of inverse transcription investigated by RT-PCR. Mice bone marrow cells were isolated and, induced and cultured with rmGM-CSF and rmIL-4. Inverted microscope and Scanning electron microscope were used to investigate the morphous of DC cells. The phenotypes of DC was detected by flow cytometry and the expression of the GM-CSF protein in serum was tested by ELISA. ResultsThe expression of the GM-CSF protein in serum in 100 μg group and 200 μg GM-CSF plasmid group were both increased significantly compared with the normal control group. The degree of CD11c and MHC-Ⅱ expressions in 100 μg and 200 μg groups on flow cytometry were elevated significantly compared with that in control group, and the degree of CD80 and CD86 was increased. ConclusionThe transfection of the GM-CSF plasmid in vivo could stimulate the proliferation of the pre DC of bone marrow, and enhance antigen presentation of DC. 【Key words】Granulocytemacrophage colonystimulating factor; Dendritic cell; Induced in vivo 树突状细胞(dendritic cells, DC)是已知功能极强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，可以在体内向T淋巴细胞提呈抗原并诱发细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。慢性乙型肝炎患者DC的功能存在一定的缺陷。体外研究表明，GM-CSF有诱导外周血单核细胞向DC转化的作用，通过增强患者DC的功能可能是治疗慢性乙型肝炎的一种有效措施。为此，我们用 GM-CSF表达质粒转染BALB/c小鼠，通过持续表达的GM-CSF在体内诱导DC的产生和成熟，以增强其对HBV抗原的提呈作用，提高机体对HBV的免疫反应。 材料与方法 一、实验动物与试剂 雄性SPF级BALB/c小鼠,4～6周龄，体重15～20 g(中国科学院上海实验动物中心)，清洁级条件喂养，自由进食进水。pGM-CSF由英国皇家兽医学院惠赠，大肠杆菌top10由瑞金医院分子生物学研究所提供， rmGM-CSF和rmIL-4为英国Biosource公司产品。FITC标记的抗小鼠MHC-Ⅱ(Iab)、CD11c、CD80、CD86抗体及同型对照为Erotec公司产品。小鼠GM-CSF ELISA检测试剂盒为Biosouse公司产品。灭活新生小牛血清为Hyclone公司产品。RPMI-1640培养基为Gibco公司产品。脂质体 2000细胞转染试剂盒和Trizol RNA抽提试剂盒均为Invitrogen公司产品。LPS（ E.coli.0 111:B4）为Gibco公司产品。DNA质粒抽提试剂盒为Qiagen公司产品。PCR引物由上海生物工程公司合成。PCR试剂盒为北京博大泰克公司产品。 二、方法 （一） pGM-CSF脂质体介导体外转染C2C12细胞，观察质粒转染效率 1． 复苏C2C12冻存细胞加入RPMI-1640 5 ml培养液，将稀释后细胞吸入培养瓶中，置37℃ 5％ CO2温箱中培养。 2． pGM-CSF质粒体外转染C2C12细胞转染前1 d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度可达到90％,将稀释的DNA和脂质体 2000充分混匀，置37℃温箱中20 min，直接将复合物加入到培养板中,摇动培养板,轻轻混匀。转染结束48 h后,抽提细胞RNA,进行反转录PCR,观察GM-CSF质粒转染后表达情况 3． RT-PCR检测转染24、48、72 h的GM-CSF水平取mRNA 1～5 μg,oligo DT 1.0 μl,DEPC水9.0 μl,混匀,短暂离心,70℃火溶10 min,冰上放置2 min。加入5×逆转录缓冲液4.0 μl，DTT 2.0 μl,dNTP 1.0 μl，混匀，42℃火浴2min，后加入逆转录酶Ⅱ 1.0 μl。42℃ 60 min,70℃15 min,得到cDNA模板。PCR扩增，反应体系为cDNA 1.0 μl，10×缓冲液2.5 μl, dNTP 0.5 μl,Mgcl2 1.0 μl,3′端引物0.2 μl，5′端引物0.2 μl，taq酶0.3 μl。充分混匀后，95℃ 4 min，94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，32个循环后，72℃灭活10 min。 (二) 动物分组30只BALB/c小鼠随机分为正常对照组（10只），100 μg组（10只）和200 μg组（10只）。正常组于右后肢股四头肌注射100 μl生理盐水。其余两组分别注射100 μl（分别含质粒100 μg和200 μg）pGM-CSF的稀释液，7 d后处死。 （三）GM-CSF表达质粒转染BALB/c小鼠骨骼肌 1. 抽提GM-CSF表达质粒步骤如Qiagen质粒抽提试剂盒操作说明，并通过琼脂糖凝胶电泳定量及分光光度计定量，并稀释终液浓度为500 ng/μl，于-80℃冰箱保存。 2. 小鼠骨骼肌注射裸质粒pGM-CSF在小鼠右后肢股四头肌肉注射0.5% 布比卡因溶液50 μl，诱导骨骼肌细胞变性。2 d后于同一部位分别注射100 μl GM-CSF质粒(100 μg和200 μg)，深度2 mm。待1周后处死小鼠。取小鼠右后肢骨四头肌，抽提RNA,通过RT-PCR观察局部骨骼肌内质粒转染情况。摘眼取血，用ELISA法检测血清中GM-CSF表达情况，并定量分析。 (四) DC的培养和表面分子的检测 1. 骨髓来源DC 的体外诱导及培养将小鼠拉椎处死，在无菌条件下剥离股骨,RPMI-1640 培养液冲洗骨髓腔,获得骨髓细胞混合液,离心弃上清液,培养液洗2次，用红细胞裂解液(Tris NH4Cl)处理后,以含10％FCS RPMI-1640液调整细胞的密度为2×106/ml,加入到6孔培养板中,每孔2 ml，贴壁2 h,去除悬浮细胞, 加入含细胞因子rmGM-CSF(100ng/ml)和rmIL-4(50 ng/ml) 的完全培养基,置于37℃、5% CO2 条件下培养, 隔天半量换液,补加细胞因子。培养第7天，加入LPS刺激48 h。倒置显微镜观察并拍照。 2． 电镜检测用DC悬液4℃预冷的3%戊二醛在4℃固定过夜，PBS洗2次，每次10 min，再用1%锇酸在4℃固定1 h， PBS洗2次，每次10 min。梯度酒精脱水，干燥，进行扫描电镜（SEM）检测（上海交通大学医学院电镜教研室）。 3. DC表面分子的检测收集细胞用FITC荧光标记的抗CD80、CD86、MHC-Ⅱ及CD11c单克隆抗体5 μl，室温避光作用30 min。离心收集细胞，上流式细胞仪检测。 三、统计学处理 使用SPSS 10.0对数据进行分析处理，数据结果以均数±标准差表示，流式结果采用配对q检验，ELISA结果采用t检验。 结果 一、体外转染的观察 体外脂质体 2000包裹质粒转染C2C12细胞, 抽提RNA,进行RT-PCR。结果可见清晰的目的条带,可以证明质粒可以在骨骼肌细胞中表达.为体内试验提供依据。pGM-CSF骨骼肌转染和RT-PCR后在电泳图上可见清晰的目的条带，说明质粒pGM-CSF在小鼠体内成功转染。100 μg和200 μg在注射7 d后，均有较为清晰的目的条带，结果见图1 二、DC形态观察 细胞培养至第3 天可见贴壁的单核巨噬细胞和半贴壁细胞,体积变大,形状不规则呈星状、蝌蚪状或梭形,有大量突起,即为DC;第4～7天可见部分细胞脱壁，细胞数渐增,形状呈特征性星形,有2～5 个不等的突起,有的较长,但仍见梭形; 第7 天加入LPS 48 h 后,DC 大量脱壁,少部分仍呈贴壁状态,而且树突状分支增加,更粗大(见图2 A、B、C略)。 图2（略） 三、流式细胞仪检测结果 与对照组比较，100 μg组和200 μg组的结果显示，CD11c和MHC-Ⅱ表达明显升高(P<0.01），CD80和CD86有所升高（P<0.05）,但低剂量组和高剂量组之间差异无显著性(见表1略)。 四、血清中GM-CSF ELISA检测结果 ELISA检测表明，对照组、100 μg组和200 μg组血清中GM-CSF表达量分别为（0.2885±0.06）、（0.3674±0.103）和（0.3949±0.116）。与对照组相比100 μg组和200 μg组血清中GM-CSF表达量均有明显升高（P<0.01）。 讨论 HBV感染后人体产生的免疫反应涉及多个环节。以往的研究表明，在免疫反应增殖阶段，慢性乙型肝炎患者HBV特异性淋巴细胞增殖反应下降；在效应阶段，CTL功能减弱，且增强机体免疫的有关细胞因子水平低下［1，2］。DC作为体内功能最强的专职抗原提呈细胞，是机体T细胞免疫应答的直接启动者。对乙型肝炎外周血DC的研究认为，慢性HBV感染者外周血DC的增殖指数明显降低，表达于DC表面的共刺激分子（CD80、CD86、CD1α）及MHC-Ⅱ类分子（HLADR）明显低于正常人，表明慢性乙型肝炎持续感染与DC的功能缺陷——其表型不成熟及刺激T淋巴细胞增殖能力降低有关［3］,而改变其功能状态有望打破慢性HBV感染形成的免疫耐受。 体内DC主要来源于骨髓, 在小鼠、大鼠及人的骨髓中均含有大量前体细胞 ,再分布到全身组织中。有研究表明，GM-CSF可促进髓系DC细胞的发育，诱导外周血单核细胞向DC转化，是维持其分化和发育环节最基本的细胞因子［4］。我们将GM-CSF裸质粒直接注射于小鼠骨骼肌,获得了GM-CSF在小鼠体内的表达。结果表明,GM-CSF基因直接注射骨骼肌后7 d左右表达量最高,并持续到15 d。 本实验首先观察了体外GM-CSF质粒在C2C12细胞中的转染效率，为体内转染奠定了实验基础。在预初实验时分设了不同的注射剂量组和时间段组，分离骨骼肌，抽提RNA，采用半定量PCR观察反转录水平。结果发现，注射剂量为100 μg和200 μg，时间为1周时，表达量较高，这与文献报道一致。由于DC在外周血中含量极少，仅占单核细胞总数的0.1%～1%,分离纯化困难，因此本实验采用体内注射与体外诱导相结合的方法检测GM-CSF对髓源性DC前体的促增殖作用，从而说明体内GM-CSF对DC成熟的诱导作用。实验结果显示，两个注射剂量组，血清中GM-CSF表达量均较对照组有明显升高，但两组间比较差异无显著性。流式细胞仪检测结果显示，经不同剂量的体内转染，所获得的成熟DC数量均较对照组有所升高，但CD80和CD86表达水平相对DC特异性标志CD11c有所偏低，说明还有部分DC为未成熟DC。实验说明GM-CSF的体内转染可以促进髓源性DC前体数量的增加或增强DC前体向成熟DC转化的能力，这将对探索治疗慢性乙型肝炎的有效措施具有重要价值。 参考文献 Kakumu S,Ito S.Ishikawa T,et al.Decreased function of peripheral blood dendritic cells in patinents with hepatocelluar carcinoma with hepatitis B and C virus infection .Gastroenterol Hepatol，2000,15∶431-436. 2De Vries IJ,Ggert AA,Scharenborg NM,et al.Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J Immunolther, 2002,25∶429-438. 3黄建宏，欧兴义，梁小兵，等.乙型肝炎病毒DNA检测及其与血清标志物的关系探讨.实用诊断与治疗杂志，2005,19∶4-8. 4Daro E, Pulendran B, Brasel K, et al. Polyethylene glycolmodified GM-CSF expands CD11b(high) CD11 c(high) but not CD11b(low)CD11c(high) murine dendritic cells in vivo: a comparative analysis with FltFlt3 ligand. J Immunol,2000,165∶49-58. 上海《肝脏》杂志社版权 |