【摘要】目的初步探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者血清和外周血单个核细胞(PBMC)白细胞介素-18(IL-18)水平与乙型肝炎病毒(HBV)感染的关系。方法ELISA 法检测HBV感染者（轻、中、重度三组）和正常组的血清与PBMC IL-18水平，同时检测血清ALT / AST水平；荧光定量PCR检测 各组患者血清和PBMC HBV DNA 量，并分成HBV DNA病毒载量低、中、高三组。结果CHB各组患者间血清和PBMC 培养上清IL-18水平有显著差异 （P<0.05），由高到低依次为：重度组、中度组、轻度组；血清IL-18水平较对照组明显升高（P<0.05）, PBMC 培养上清IL-18水平明显低 于对照组（P<0.05）；不同血清病毒载量组，血清IL-18水平有显著差异（P<0.05）: 由高到低依次为：低病毒载量组、中病毒载量组、高病毒载量组; PBMC内HBV DNA 阴性组IL-18水平明显高于HBV DNA阳性组（P<0.05）；CHB患者血清IL-18水平与血清ALT/AST 呈显著正相关。结 论IL-18可能参与了CHB的免疫应答，在清除HBV感染同时也造成了肝细胞炎性损伤，其与肝细胞损伤严重程度有一定的相关性。 【关键词】慢性乙型肝炎； 白细胞介素18； 外周血单个核细胞； 病毒载量 The relationship between the expression levels of IL-18 in serum and PBMC and the severity of HBV infection in patients with chronic hepatitis BMA Qingfeng, WANG Wei， LI Li, XIONG Liang, CHEN Qingsong.Department of Clinical Laboratory, Liyuan Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430076, China 【Abstract】ObjectiveTo study the relationship between the expression level of IL-18 in serum and PBMC of patients with CHB and severity of HBV infection.MethodsIL-18 levels were detected by ELISA method in serum and PBMC,at the same time,ALT/AST levels were detected;HBV DNA levels were detected by the fluorescence quantitative PCR method,according to HBV DNA load, patients with CHB were divided into low(≤103 copies/ml),middle(104～106 copies/ml) and high (≥107 copies/ml) virus load groups.ResultsIL-18 levels in serum and PBMC in patients with CHB were siginificantly differert(P<0.05):the levels of IL-18 decreased in an order from severe,moderate and mild groups;the levels of IL-18 in serum was siginificantly higher than those in control group,the level of IL-18 in PBMC was siginificantly lower than those in control group; IL-18 levels in different virus load groups were siginificantly differert(P<0.05):the levels of IL-18 decreased in an order from low,middle and high virus load groups;the level of IL-18 in HVB DNA negative group was siginificantly higher than those in HBV DNA positive group;The level of IL-18 in serum of patients with CHB were positively correlated with levels of ALT/AST in serum.ConclusionIL-18 may be involved in the host immunity against HBV,and is associated with HBV clearance and liver damage,the level of IL-18 was related with the degree of liver damage. 【Key words】Chronic hepatitis B; IL-18; PBMC; viral load 乙型肝炎的发病是乙型肝炎病毒(HBV)与机体之间相互作用的结果，现有研究发现免疫损伤是一个重要方面，细胞因子在其中的作用越来越受到重视。白细胞介素-18 (IL-18 )是一种前炎性细胞因子，可以刺激IFNγ产生，增强NK 细胞毒作用和诱导Th1介导的免疫反应。近年来IL-18被认为是调节Th1/Th2细胞因子的重要因子，在Th1/Th2细胞平衡中发挥重要作用，其抗 肿瘤、抗胞内感染作用已得到广泛认同［1、2］。本实验对不同临床类型的HBV 感染者血清和PBMC IL-18水平及HBV DNA量进行检测，以探讨 IL-18与HBV 感染的关系，以及其在慢性乙型肝炎(CHB)发病及免疫损伤的作用。 材料与方法 一、研究对象 随机选取华中科技大学附属梨园医院门诊或住院的CHB患者33例作为研究组，其中CHB轻度组12例, 中度组11例，中度组10例；所有病例的诊断符合2000年中华医学会西安会议修订的病毒性肝炎防治方案标准并排除其他病毒性肝炎感染。11例正常对照均为健康体检者。 二、试剂与仪器 人IL-18 ELISA 试剂盒购自深圳晶美有限公司；淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂；酶标仪为美国MR5000 ；HBV DNA荧光定量PCR试剂盒购自 深圳达安基因公司；荧光定量PCR仪为美国PE公司5700型；RPMI1640和LPS 购自美国Sigma公司；生化分析仪为日本奥林巴斯AU400型。 三、标本采集 无菌采取静脉血10 ml, 2 ml 放入肝素锂抗凝试管中，离心取上清，液氮冻存，以备同一批次检测血清IL-18和HBV DNA 量；5 ml 放入肝素 锂抗凝试管中，常规分离单个核细胞层，用RPMI1640液洗涤两次，计数细胞后调整细胞至106个/ml,种入24孔培养板，加入LPS 终浓度为0.1 μg/ml, 置37℃ 5%CO2培养箱培养6 h, 离心取上清，液氮冻存，以备同一批次检测培养上清IL-18水平； 3 ml 放入EDTAK2抗凝试管中, 常 规分离单个核细胞层, 提取PBMC DNA，用于检测PBMC内 HBV DNA的量。 四、实验室检测及分组 IL-18水平的检测严格按照ELISA试剂盒的说明书进行操作；ALT/AST检测采用日本奥林巴斯AU400 型全自动生化分析仪,试剂由浙江东瓯公 司提供；HBV DNA 定量检测试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心研制，按说明书严格操作,PE5700型全自动分析仪自动计算样品拷数(M), 样品的HBV DNA 量(拷贝/ml)=1 000×M；HBV DNA分组: 33例HBV感染者HBV DNA小于或等于103拷贝数/ml为低病毒载量组，104～106拷贝 数/ml为中病毒载量组，大于或等于107拷贝数/ml为高病毒载量组。 五、统计学处理 计量资料用x±s表示，采用t检验，IL-18水平与血清ALT/AST相关性采用直线相关分析。本研究采用SPSS 8.0 软件进行统计。 结果 一、不同临床类型HBV感染者血清IL-18水平的检测 CHB各组患者间血清IL-18水平有显著差异（P<0.05）, 由高到低依次为：重度组、中度组、轻度组。CHB各组患者血清IL-18水平较正常对照组明显升高（P<0.05）。血清IL-18水平与CHB疾病严重程度有一定相关，疾病程度越严重其血清IL-18水平相应升高。 二、不同临床类型HBV感染者PBMC培养上清IL-18水平的测定 CHB各组患者间PBMC培养上清IL-18水平有显著差异（P<0.05）, 由高到低依次为：重度组、中度组、轻度组。CHB各组患者PBMC培养上清IL-18水平较正常对照组明显降低（P<0.05）。PBMC IL-18水平与CHB疾病严重程度有一定相关，疾病程度越严重其PBMC IL-18水平相应的升高 。 三、慢性乙型肝炎患者血清病毒载量与血清IL-18的关系 根据血清HBV DNA量的高低，将33例HBV感染者分为3组：HBV DNA≤103拷贝/ml为低病毒载量组，104～106拷贝/ml为中病毒载量组，≥107拷贝 /ml为高病毒载量组。不同病毒载量组间血清IL-18水平有显著差异（P<0.05）, 由高到低依次为：低病毒载量组、中病毒载量组、高病毒载 量组。 血清IL-18水平升高则其相应的血清HBV DNA下降，IL-18可能参入了HBV DNA 的清除。 四、PBMC 内HBV DNA 量与IL-18水平的关系 根据PBMC内病毒DNA量的有无，将33例HBV感染者分为两组：HBV DNA 阳性组和HBV DNA 阴性组。HBV DNA 阳性组与HBV DNA 阴性组间血清IL-18水平有显著差异（P<0.05），HBV DNA 阴性组血清IL-18水平高于阳性组。 五、不同临床类型CHB患者血清IL-18水平与肝功能的关系 CHB患者血清IL-18水平与血清ALT/AST水平呈显著正相关（r=0.98, P<0.05），显示血清IL-18水平与肝细胞损伤程度有关，即血清IL-18水平越高，肝细胞破坏程度越大。 讨论 CHB发病机制目前尚未完全清楚，普遍认为细胞免疫反应是HBV感染后引起肝细胞损伤的主要机制［3］。细胞免疫应答主要通过杀伤性T细胞、 NK细胞及ADCC作用来完成的。细胞毒性T细胞对感染肝细胞的识别和杀伤被认为是引起肝细胞损伤和病毒清除的中心机制。Th1/Th2细胞间的平 衡在调节肝细胞损伤中起重要作用，Th1/Th2细胞失调可能是HBV感染慢性化主要机制之一［4］。如果Th1细胞占优势，将促进细胞免疫，增 强CD8+ T细胞的活性，从而清除细胞内病毒，但同时也加重肝细胞的损伤，倾向于发生急性或自限性感染；如果Th2细胞占优势，将抑制细胞免疫，肝细胞损伤减轻，从而发生持续的HBV感染。 IL-18是一种强有力的免疫调节因子，参与宿主抗胞内感染、肿瘤免疫等［5，6］。IL-18通过诱生IFNγ和其他细胞因子 ( IL-2、GM-CSF等)的产生而形成IL-18/Th1细胞因子组成的细胞因子级联：促进Th1增殖和参与免疫应答调控；增强NK细胞的细胞毒性和CTL细胞的活性；上调FasL在T细胞/NK细胞/CTL细胞的表达，增强FasL介导的细胞毒效应。 IL-18作为一种炎症因子，在乙型肝炎的肝脏损害中发挥重要作用［7，8］。但与其他Th1型细胞因子一样，IL-18在机体抵抗病原微生物的侵袭和致病中发挥重要的双重调控作用。一方面是促进疾病发生发展的重要炎症间质；另一方面可保护机体，清除病原微生物，其致病性同时 是抗感染、清除病毒的体现。 本实验结果显示，不同临床类型CHB患者血清和PBMC培养上清液IL-18水平均明显增高，各组间有显著差异；血清和PBMC IL-18水平由高到低 依次为：慢性肝炎重度组、中度组、轻度组，这提示IL-18水平在不同类型的CHB患者血清和PBMC 内表达增高，且增高程度与病情严重程度相关。 已有研究证实，Th1诱导因子与抗HBV免疫有关［9］，研究发现IL-18基因的转录与表达水平越低，血清HBV DNA水平越高。而高HBV DNA载量 反映了乙型肝炎患者体内抗HBV免疫呈低水平。IL-18可能参与HBV的清除。我们的实验结果显示：高、中、低三组不同病毒载量间血清IL-18 水平有显著差异，由高到低依次为：低病毒载量组、中病毒载量组、高病毒载量组。这可能由于在某种因素启动下，机体的内环境改变，IL-18优势表达，并通过其所激发的细胞因子级联反应，增强了细胞免疫应答及其他细胞杀伤途径，清除HBV感染的靶细胞，使HBV复制水平降低，同时也造成肝细胞的损伤。 我们发现IL-18的产生与PBMC内HBV DNA水平有关，有文献报道［10］HBV感染人单核/巨噬细胞系THP1后，前炎症因子IL-1＼IL-6 mRNA、蛋 白水平均下降，HBV通过抑制前炎症因子的产生，从而有利于感染的持续存在。IL-18与IL1有相似的结构及信号转导途径，均需要ICE(IL- 1BETA转化酶)加工。我们推测HBV感染免疫细胞后，可能影响IL－18的信号转导途径，从而引起IL-18水平下降，这样有利于HBV的复制，免疫 细胞呈HBV DNA高负荷状态。我们的研究结果显示，PBMC内HBV DNA 阳性组与HBV DNA 阴性组间血清IL-18水平有显著差异，HBV DNA 阴性组 血清IL-18水平高于阳性组同样也证明了IL-18可能参与了HBV DNA 的清除。 病毒感染一方面启动宿主的免疫系统，另一方面可能通过各种渠道影响免疫效应的发挥。综上所述，IL-18可能参与了宿主的抗HBV免疫应答，并且在不同的感染状态表达水平不同，与病情活动度有关。 参考文献 1Oh S, Hodge JW, Ahlers JD, et al. Selective induction of high avidity CTL by altering the balance of signals from APC. J Immunol, 2003, 170∶2523-2530. 2Lopez RD, Waller EK, Lu PH, et al. CD58/LFA3 and IL12 provided by activated monocytes are critical in the in vitro expansion of CD56+ T cells. Cancer Immunol Immunother, 2001, 49∶629-640. 3Rapicetta M, Ferrari C, Levrero M. Viral determinants and host immune responses in the pathogenesis of HBV infection. J Med Virol, 2002, 67∶454-457. 4Nakanishi K, Yoshimoto T, Tsutsui H, et al. Interleukin18 is a unique cytokine that stimulates both Th1 and Th2 responese depending on its cytokine milieu. Cytokine Growth Factor Rev, 2001, 12∶53-72. 5Papadakis KA, Prehn JL, Landers C, et al. TL1A synergizes with IL12 and IL-18 to enhance IFNgamma production in human T cells and NK cells. J Immunol, 2004,172∶7002-7007. 6Mavropoulos A, Sully G, Cope AP, et al. Stabilization of IFN{gamma} mRNA by MAPK p38 in IL12and IL-18stimulated human NK cells. Blood, 2004, 2∶［Epub ahead of print］. 7Tsutsui H, Adachi K, Seki E, et al. Cytokineinduced inflammatory liver injuries. Curr Mol Med, 2003,3∶545-559. 8Lee MO, Choi YH, Shin EC, et al. Hepatitis B virus X?protein induced expression of interleukin 18 (IL-18)： a potential mechanism for liver injury caused by hepatitis B virus (HBV) infection. J Hepatol, 2002,37∶380-386. 9Dinarello CA, Fantuzzi G. Interleukin18 and host defense against infection. J Infect Dis , 2003,187(Suppl 2)∶S370-384. 10Sun Y, Chen HY, Sin SJ. Effect of IL-18 on perirpheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis B and hepatitis B virus DNA released by Hepag2.2.15 cell lines Hepatobiliary. Pancreat Dis Int, 2004,3∶230-234. 上海《肝脏》杂志社版权 |