【摘要】 目的 应用蛋白质组学技术从蛋白质水平寻找肝癌耐药相关的蛋白质分子。 方法 以长春新碱（VCR）诱导HepG2细胞建立的耐药肝癌细胞HepG2/VCR为研究对象, 用二维电泳技术分离两种细胞的总蛋白, 对差异表达的蛋白质点用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱及电喷雾串联质谱进行分析鉴定。再用反义核酸抑制该差异蛋白质表达以研究其与耐药的关系。 结果 鉴定出一个在肝癌耐药细胞株HepG2/VCR中高丰度表达的蛋白质为热休克蛋白27（HSP27）, 反义核酸抑制HSP27的表达后增强了HepG2/VCR对VCR的化疗敏感性（P<0.05）。 结论 HSP27可能是与肝癌细胞株HepG2/VCR耐药密切相关的蛋白质。
【关键词】 癌，肝细胞； 蛋白质组； 多药耐药性
Heat-shock protein 27 linked to multi-drug resistance in human hepatic cancer cell lines PENG Shi-fang, FU Lei, TAN De-ming. Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China
Email: shifang70peng@ yahoo.com
【Abstract】 Objective A proteomics approach was applied for finding multi-drug resistance (MDR) related proteins in hepatic cancer cell lines. Methods Two-dimensional electrophoresis (2-DE) was used to separate the total proteins of vincristine-resistant hepatic cancer cell line HepG2/VCR and its counterpart HepG2. The differential expression proteins between the two cell lines were identified by both MALDI-TOF-MS and ESI-Q-TOF-MS. Heat-shock protein 27 (HSP27), one of the differential expression proteins in the development of MDR of HepG2/VCR, was analyzed by HSP27 antisense oligonucleotides (ASOs). Results As a high expression protein in HepG2/VCR, HSP27 was identified, and the suppression of HSP27 expression by HSP27 ASO enhanced the vincristine chemosensitivity of HepG2/VCR (P < 0.05). Conclusion HSP27 is linked to MDR in human hepatic cancer cell line HepG2/VCR.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Proteome; Multi-drug resistance
肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是指肿瘤细胞接触一种化疗药物并对其产生耐药后，同时对其他化学结构和作用机制不同的化疗药物亦产生耐药[1]。肝癌是我国恶性肿瘤中发病率和恶性程度较高的一种，对于不可切除肝癌的治疗主要采用综合治疗方案，其中化疗具有相当重要的地位。在化疗药物治疗过程中多因肝癌细胞耐药而疗效不佳。深入研究肝癌细胞的MDR无疑有重大意义。虽然目前我们已对MDR的发生机制在基因水平有很深刻的了解，但仍然不能完全解释MDR。我们采用蛋白质组学技术寻找耐药相关的蛋白质分子以揭示肿瘤细胞的MDR产生机制，并为临床MDR逆转治疗提供新的蛋白质作用靶点。我们前期研究发现热休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）在肝癌耐药细胞株中高表达[2]，与肝癌耐药密切相关。
材料与方法
1. 细胞株：人肝癌细胞株HepG2由本研究所冻存，肝癌多药耐药细胞株HepG2/VCR的建立采用长春新碱（VCR）梯度逐步诱导法[3]，直至HepG2/VCR细胞能在含VCR 1mg/L的培养液中维持生长。
2. 试剂：丙烯酰胺、甲叉一双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、SDS、超纯尿素、CHAPS（3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate）去垢剂、IPG（immobilized pH gradient, 固定pH梯度）胶条pH3～10、覆盖液等均购自瑞典Amershan Pharmacia公司。二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺、TPCK(经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)处理的胰蛋白酶、铁氰化钾、三氟乙酸、碳酸氢铵、硫代硫酸钠、乙腈、氰基-4-羟基肉桂酸（CCA）等购自美国Sigma公司。鼠抗人HSP27单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠第二抗体购自美国Santa Cruz公司。
3. 仪器：IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT垂直电泳槽、Imagescanner扫描仪为瑞典Amersham Biosciences公司产品。Applied Biosystem Voyager DE STR BiospectrometryTM Workstation System 4307基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）仪为美国ABI公司产品。Q-TOF microTM电喷雾串联质谱（ESI-Q-TOF）仪为英国Micromass公司产品。
4. 双向凝胶电泳：收集对数生长期HepG2、HepG2/VCR细胞，加入细胞裂解液（8mol/L尿素、4% CHAPS、40mmol/L Tris、65mmol/L DTT）裂解2h，低温12000r/min离心45min后取上清液，部分用于Bradford法测总蛋白浓度,余分装，置-80℃冻存备用。细胞总蛋白0.25mg与水化液（8mol/L尿素、4% CHAPS、40mmol/L Tris、18mmol/L DTT、0.5% IPG缓冲液pH3～10、衡量溴酚蓝）混合，上样总体积450μl。30V水化14h后经500V 1h、1000V 1h、8000V 10h进行等电聚焦。等电聚焦后分别于10ml平衡A液（50mmol/L Tris-HCl pH 8.8、6mmol尿素、30%甘油、0.2% DTT、衡量溴酚蓝）和10ml平衡B液（50mmol/L Tris-HCl pH 8.8、6mmol尿素、30%甘油、3%碘乙酰氨、衡量溴酚蓝）各平衡15min。平衡后将IPG胶条转移至12%的0.75mm SDS-PAGE胶上端进行第二向垂直电泳。银染显色：40%乙醇溶液、10%冰醋酸固定60min，30%乙醇溶液、5%硫代硫酸钠、6.8%醋酸钠敏化30min，双蒸水洗2次，5min/次，2.5%硝酸银染色20min，双蒸水洗1min，2.5%碳酸钠、0.074%甲醛显影；1.46% EDTA终止10min，双蒸水洗10min，30%乙醇溶液、4.6%甘油保存。
5. 图像分析：用Imagescanner扫描仪对染色的二维电泳（2-DE）胶扫描。HepG2及HepG2/VCR每株细胞选3张双向电泳图，用PDQuest 2-DE软件进行匹配成组，组间比较并选取2倍以上变化的蛋白质点为耐药与非耐药细胞差异表达的蛋白质分子[4]。
6. 差异蛋白质点的质谱分析：切割蛋白质点于1.5ml EP管中，100mmol硫代硫酸钠和30mmol铁氰化钾（1∶1）脱色，水洗数遍后乙腈脱水冷冻抽干。加入10μl TPCK处理的胰蛋白酶（0.1μg/ml）冰上吸胀40min，37℃酶解12h，30μl萃取液（100%乙腈与5%三氟乙酸等量混合）萃取60min，重复2次。将萃取液收集于0.5ml EP管冷冻浓缩约10μl，取0.5μl样品与1μl基质液CCA混合，点样于不锈钢板。MALDI-TOF-MS质谱仪采用反射模式、正离子谱测定，离子源加速电压20000V，反射电压比为1.12，N2激光波长337nm,脉冲宽度3ns，离子延迟提取100ns，真空度4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，质谱使用胰蛋白酶自降解峰质/荷比842.50和2211.10作为内校正，获得肽质量指纹图谱。Mascot软件检索SwissProt数据库鉴定差异表达蛋白质。为进一步验证由肽指纹图谱获得的差异蛋白质点，所有样品均进行ESI-Q-TOF分析，并对部分肽片段测序，得到相应的肽序列标签。所有测定均在正离子方式下进行。雾化气体为氮气，碰撞气体为氩气。源温80℃，锥孔电压50V，TOF加速电压为0.2kV，MCP检测器电压为2.7kV；LC-ESI-MS/MS自动分析时，毛细管电压为3000V。测定结果仪器以peaklist文件形式给出，通过Mascot软件检索SwissProt数据库鉴定蛋白质点，并得到部分肽片段测序。
7. HSP27反义核酸转染HepG2/VCR细胞：全硫代修饰的HSP27反义核酸由日本TaKaRa公司合成，反义链针对HSP27基因翻译起始区设计，序列为5′-GGGACGCGGCGCTCGGTCAT-3′，错义链5′-CAGCGCTGACAACAGTTTCAT-3′为对照。细胞转染按脂质体Oligofectamine说明书进行。转染前一天以1×105/ml密度接种96和6孔培养板,约50%融合时进行转染。HSP27反义核酸与Oligofectamine于无血清培养液预孵育20min后加入培养板，调整终浓度为200nmol/L。转染4h后，换为含体积分数10%小牛血清的培养液继续培养24h，Western blot检测HSP27的表达情况。转染结束后加入含不同浓度VCR的培养液继续培养24h，MTT法检测细胞存活率。实验至少重复3次。
8. Western blot分析：15μg总蛋白进行12.5% SDS-PAGE分离，蛋白质转移至硝酸纤维膜上，印迹膜5%脱脂牛奶室温封闭2h，1∶2000稀释的鼠抗人HSP27第一抗体室温温育1h，PBS洗涤3次，10min/次。1∶3000稀释的羊抗鼠第二抗体室温温育1h，PBS洗涤3次，化学发光试剂ECL发光及显影。以Tublin为内参照。实验至少重复3次。
9. 统计学分析：计量资料用t检验。
结 果
1. PDQuest 2-DE软件分析HepG2与HepG2/VCR双向电泳图：分别可检测到大约1100个蛋白质点，共有20多个差异表达的蛋白质点，双向电泳图重复性好（图1）。在分子量约2.1×104、等电点值约6.5的位置发现一个在HepG2/VCR细胞株中高丰度表达的蛋白质点。
2. 差异蛋白质点分析及验证：差异蛋白质点胶内酶解，经MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱分析及ESI-Q-TOF肽序列标签验证得以鉴定。该差异蛋白质的肽质量指纹图谱经SwissProt数据库检索，提示为HSP27；经ESI-Q-TOF验证，来自该差异蛋白质的肽片段质/荷比954.1470被鉴定为LATQSNEITIPVTFESR, 为HSP27的172～188位氨基酸序列。HSP27的鉴定见图2，表1。
3. HSP27反义核酸抑制HSP27的高表达： Western blot分析结果提示HSP27反义核酸显著抑制HSP27的表达，而错义核酸和脂质体无明显作用（图3A）。HSP27反义核酸对HSP27的抑制增强了HepG2/VCR对VCR的化疗敏感性（图3B）。提示抑制HSP27的高表达可能逆转HepG2/VCR的MDR。
讨 论
蛋白质是细胞和组织的生命现象和生理活动的主要执行者，应用蛋白质组学技术从蛋白质水平来研究肿瘤细胞的MDR，从而筛选耐药相关的蛋白质无疑有着重要价值。肿瘤的MDR机制十分复杂，已发现的耐药相关蛋白质有p170糖蛋白、多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白、谷胱甘肽S转移酶、拓扑异构酶、蛋白激酶C、乳腺癌耐药相关蛋白、超氧化物歧化酶等。但都不能完全解释多药耐药现象。
我们用蛋白质组学技术发现HSP27在肝癌耐药细胞株中高表达，其基因的启动子区有热休克调节元件及应激相关调节元件，可形成分子量为4.0×105～8.0×105的寡聚体。该寡聚体的解离与聚合具有不同的生物学功能，如调节细胞间的活性氧化物、维持谷胱甘肽水平时需聚合成寡聚体，而行使分子伴侣功能时则需解聚。将HSP27 cDNA转染小鼠胚胎干细胞，高表达HSP27的细胞获得抗顺铂以及镉、砷和汞化合物的能力[5]。Chung等[6]研究显示高表达HSP27的肿瘤细胞株对阿霉素的抵抗能力增加。Mehlen等[7]研究表明HSP27可以减少组织间活性氧，增加谷胱甘肽水平，参与细胞解毒功能。HSP27还可以防止细胞骨架的破坏，维护细胞骨架的稳定，防止Tublin解聚，拮抗VCR对肿瘤细胞纺锤体的破坏作用[8]。本研究中HSP27不仅在HepG2/VCR细胞中高表达，而且反义核酸抑制HSP27的表达能增强HepG2/VCR细胞对VCR的敏感性，说明HSP27高表达与HepG2/VCR细胞的MDR有关。
关于HSP27参与耐药的机制，我们目前正在研究，采用HSP27抗体与HepG2/VCR细胞的蛋白质进行免疫共沉淀，再用SDS-PAGE分离免疫共沉淀复合物，采用ESI-Q-TOF串联质谱技术对与HSP27相互作用的蛋白质进行鉴定。初步研究结果显示，与HSP27相互作用的蛋白质多为与细胞骨架相关的蛋白质。但是HSP27的功能极为复杂，其确切作用机制仍需要进一步研究。
参 考 文 献
[1]Song HY, Liu YK, Cui JF, et al. Proteomic analysis on metastasis-associated proteins of hepatocellular carcinoma tissues. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 331-334.
宋海燕,刘银坤,崔杰峰,等.人肝细胞性肝癌组织转移相关分子的比较蛋白质组学研究.中华肝脏病杂志,2005,13:331-334.
[2]Feng JT, Liu YK, Dai Z, et al. Screening hepatocellular carcinoma autoantibodies by serological proteome analysis. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 832-835.
冯钜涛,刘银坤,代智,等.血清蛋白质组分析技术筛选肝癌自发抗体.中华肝脏病杂志,2005,13:832-835.
[3]Cai XJ, Zhang XY, Fan DM, et al. Establishment and characteristics of multidrug resistant human stomach cancer cell lines. Zhongguo Zhongliu Linchuang, 1994, 21 Suppl: 67-69.
蔡学君,张学庸,樊代明,等.胃癌多药耐药细胞株的建立及其生物学特性.中国肿瘤临床,1994,21增刊:67-69.
[4]Sinha P, Poland J, Kohl S, et al. Study of the development of chemoresistance in melanoma cell lines using proteome analysis. Electrophoresis, 2003, 24: 2386-2404.
[5]Wu W, Welsh MJ. Expression of the 25-kDa heat-shock protein (HSP27) correlates with resistance to the toxicity of cadmium chloride, mercuric chloride, cis-platinum(II)-diammine dichloride, or sodium arsenite in mouse embryonic stem cells transfected with sense or antisense HSP27 cDNA. Toxicol Appl Pharmacol, 1996, 141: 330-339.
[6]Chung YM, Park S, Park JK, et al. Establishment and characterization of 5-fluorouracil-resistant gastric cancer cells. Cancer Lett, 2000, 159: 95-101.
[7]Mehlen P, Hickey E, Weber LA, et al. Large unphosphorylated aggregates as the active form of hsp27 which controls intracellular reactive oxygen species and glutathione levels and generates a protection against TNFalpha in NIH-3T3-ras cells. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 241: 187-192.
[8]Lavoie JN, Lambert H, Hickey E, et al. Modulation of cellular thermoresistance and actin filament stability accompanies phosphorylation-induced changes in the oligomeric structure of heat shock protein 27. Mol Cell Biol, 1995, 15: 505-516.
《中华肝脏病杂志》
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