【摘要】目的观察己酮可可碱(PTX)对大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)细胞外基质合成与降解的影响。方法30只 SD大鼠随机分为模型组(10只) 、治疗组(10只)和正常对照组（10只）。模型组大鼠以高脂饲料喂养16周；治疗组大鼠高脂饮食喂养12周后加用己酮可可碱16 mg·kg-1.d-1 治疗4周；对照组大鼠以普通饲料喂养16周。在实验16周结束后处死3组所有大鼠，用RTPCR方法分别测定肝组织细胞外基质合成与降解的指标：Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP1、MMP13的mRNA水平。结果大鼠肝组织中Ⅰ型胶原mRNA的表达水平，对照组、模型组和治疗组分别为1.466± 0.212、1.890±0.078和1.553±0.129，模型组高于对照组(P＜0.05)，治疗组显著低于模型组。大鼠肝组织中Ⅲ型胶原mRNA的表达水平，对照组、模型组和治疗组分别为1.803±0.186、2.593±0.306和1.897±0.119，模型组高于对照组(P＜0.05)，治疗组显著低于模型组。大鼠肝组织中TIMP1 mRNA的表达水平，对照组、模型组和治疗组分别为1.313±0.031、1.760±0.225和1.780±0.245，模型组及治疗组均高于正常对照组(P＜0.05)，治疗组与模型组之间没有明显差异。大鼠肝组织中MMP13 mRNA的表达水平，对照组、模型组和治疗组分别为0.690±0.026 、0.700±0.010和0.821±0.020，模型组与正常对照组无明显差异；治疗组水平较对照组及模型组显著升高(P＜0.05)。结论己酮可可碱可降低NASH大鼠肝脏中细胞外基质Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成，对TIMP1的水平无明显影响，但可明显升高肝脏中MMP13的水平，对NASH引起的肝纤维 化有一定的治疗作用。 【关键词】非酒精性脂肪性肝炎； 己酮可可碱； 细胞外基质； 大鼠 Effects of pentoxifylline on synthesis and degradation of ECM in nonalcoholic steatohepatitis ratsCUI Yan, ZHANG Li, JIA Ji dong.Liver Research Center, Beijing Friendship Hospital Affiliate of Capital Medical University, Beijing 100050, China 【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of pentoxifylline on synthesis and degradation of ECM in nonalcoholic steatohepatitis rats. MethodsThirty SD rats were divided into 3 groups randomly: model group(n=10),treatment group (n=10),and normal group (n=10).The rats of model group and treatment group were given fatrich diet, and those of normal group were given normal diet. The rats of treatment group were given pentoxifylline after 12 weeks of fatrich diet feeding. At 16 weeks, all rats were sacrificed. Livers were preserved for measuring collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, TIMP1 and MMP13 mRNA expression by RTPCR.ResultsCollagenⅠmRNA expression level of model group was higher than normal group (P＜ 0.05), treatment group was lower than model group (P＜0.05). CollagenⅢ mRNA expression level of model group was higher than normal group (P＜0.05), treatment group was lower than model group (P＜0.05). The levels of TIMP1 mRNA expression in model group and treatment group were all higher than normal group (P＜0.05), but there was no significant difference between the treatment group and model group. The levels of MMP13 mRNA expression in model group was markedly higher than normal group (P＜0.05), Treatment group was markedly higher than model group and normal group (P＜0.05).ConclusionPentoxifylline can decrease the expression of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ mRNA in rats with nonalcoholic steatohepatitis but had no significant effect on TIMP1 mRNA expression, whereas significatly increase the MMP13 mRNA expression. 【Key words】Nonalcoholic steatohepatitis; Pentoxifylline; ECM; Rats 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化三种主要类型，其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)可进一步发展为肝纤维化、肝硬化等终末期病变［1］。 己酮可可碱(PTX)在临床上广泛应用于治疗脑血管病、缺血性心脏病、糖尿病、脓毒血症等，用于改善微循环。PTX通过抑制磷酸二酯酶活性，减少环磷酸腺苷（cAMP）的降解，提高细胞内cAMP浓度，降低TNFα mRNA转录,减少TNFα的产生［2］。近年来，国内外动物和临床研究显示PTX具有抗纤维化作用。Preaus等［3］研究表明，PTX可抑制肝炎患者成纤维细胞的增生，降低胶原的合成，早期应用PTX可减轻肝脏的损 伤和炎症反应。Desmouliere等［4］发现，PTX可使四氯化碳所致肝纤维化小鼠的HSC增生活性降低。在四氯化碳大鼠肝纤维化模型中，口服 PTX的大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、Ⅳ型胶原、TNFα浓度均低于对照组［5］。PTX治疗小鼠血吸虫肝纤维化可显著降低肝脏TGF-β和Ⅰ、 Ⅲ型胶原含量［6］。本实验旨在观察PTX对大鼠NASH模型的肝细胞外基质(ECM)合成和降解的影响，进一步探讨其抗纤维化作用。 材料与方法 一、材料 雄性SD大鼠30只，体重(140±10)g，购自首都医科大学实验动物中心。PTX由德国通易药业有限公司提供,每支5 ml为100 mg，进口注册证号( 中国)X20000248。TRIzol一步法RNA提取试剂盒为美国Gibco公司产品；逆转录试剂盒及相关试剂为美国Promega公司产品；PCR试剂盒为北京天为时代生物技术公司产品；PCR扩增所需引物为北京赛百盛基因技术有限公司产品。实验仪器：日本岛津公司UV2450 分光光度仪；美国MJ Research公司PTC200 PCR仪；美国BIORAD公司PowerPac Basic 电泳仪及凝胶成像分析系统。 二、方法 (一) 动物分组与模型建立30只大鼠正常喂养1周后, 按随机数字表随机分成3组,模型组10只，正常对照组10，治疗组10只。对照组饲以普通饲料，模型组和治疗组饲以高脂饲料（88%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇）。治疗组于高脂饲料饲养12周后加用PTX 16 mg·kg-1·d-1灌胃4周 。实验动物自由饮水和进食，分笼饲养于（20±2）℃明暗各12 h的动物室内。16周处死所有大鼠，方法为隔夜禁食, 2%戊巴比妥钠0.023 ml/kg腹腔注射麻醉,腹主动脉取血后迅速取出肝脏，肝组织于液氮中保存。 (二) 观察指标及测定方法实验期间每周称体重1次, 同时观察大鼠食欲、行为、状态、毛发、情况。实验结束处死动物时称体重及肝脏湿重, 并计算肝指数(肝湿重/体重×100%)。以甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照，采用RTPCR法检测细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP1、MMP 13 mRNA的表达水平。TRIzol一步法提取细胞总RNA，42 °C逆转录1 h，取逆转录产物cDNA 进行PCR扩增。引物序列见表1略。 三、统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件进行数据的统计分析，结果以均数±标准差表示。各组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。 结果 一、一般情况 实验过程中大鼠未发生死亡。模型组大鼠体毛发黄、稀疏，性情较温顺，不喜动。3组大鼠体重均呈进行性增长，实验结束时虽模型组、治疗组大鼠体重与正常对照组比较无差异，但两者的肝指数明显高于对照组（t=7.86和38.45，P<0.01）；与模型组比较，治疗组的肝指数显著降 低（t=7.07, P<0.01）,见表2略。 二、Ⅰ型胶原mRNA表达 Ⅰ型胶原mRNA的扩增产物在凝胶成像中显示为一条514 bp的特征条带(见图1)。通过图像分析得到Ⅰ型胶原mRNA的表达水平，正常对照组、模型组和己酮可可碱治疗组分别为1.466±0.212、1.890±0.078和1.553±0.129，模型组明显高于对照组(P＜0.05)，治疗组显著低于模型组(P ＜0.05)。 图1略 三、Ⅲ型胶原mRNA表达 Ⅲ型胶原mRNA的扩增产物在凝胶成像中显示为一条425 bp的特征条带(见图2)。通过图像分析得到Ⅲ型胶原mRNA的表达水平，对照组、模型组和治疗组分别为1.803±0.186、2.593±0.306和1.897±0.119，模型组显著高于对照组(P＜0.05)，治疗组显著低于模型组(P＜0.05)。 图2略 四、TIMP1 mRNA表达 TIMP-1 mRNA的扩增产物在凝胶成像中显示为一条393 bp的特征条带(见图3)。通过图像分析得到TIMP-1mRNA的表达水平，正常对照组、模型组和己酮可可碱治疗组分别为1.313±0.031、1.770±0.225和1.780±0.245，模型组显著高于正常对照组(P＜0.05)，治疗组与模型组之间无明显差异。 图3略 五、MMP-13 mRNA表达 MMP-13 mRNA的扩增产物在凝胶成像中显示为一条133 bp的特征条带(见图2)。通过图像分析得到MMP-13 mRNA的表达水平，对照组、模型组 和治疗组分别为0.690±0.026、0.700±0.010和0.821±0.020，模型组与对照组无明显差异，而治疗组较对照组和模型组有明显的升高(P＜ 0.05)。 图4略 讨论 我们前期的研究已通过病理证实应用高脂饮食成功复制SD大鼠NASH并肝纤维化模型。该模型与人类营养过剩、肥胖和高脂血症相关的NASH较为相似，可能更适用于NASH发病机制及药物干预实验。本研究发现，大鼠NASH模型中Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达水平明显高于正常对照，提示在 NASH肝脏中胶原的合成明显增加。大鼠NASH模型中MMP-13的水平与对照组没有显著差异，但TIMP1的水平较正常对照明显升高，使细胞外基质的降解减少。ECM的合成明显增加而降解减少，进一步证实了NASH可以导致肝纤维化，大鼠NASH肝纤维化模型造模成功。 新近的临床［7］和实验研究［8］应用PTX治疗NASH已取得了初步疗效，认为PTX可能通过增加谷胱甘肽过氧化物酶的作用提高谷胱甘肽的含量，促使氧化和抗氧化机制恢复平衡，阻断了自由基的链式反应，同时降低了TNF-α的水平，使肝细胞的结构、功能恢复正常。本实验结果显 示，PTX能够显著降低大鼠NASH模型中Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达水平；同时显著升高MMP-13水平；但是对TIMP-1的水平没有明显影响。提示 PTX可明显降低ECM合成，同时促进ECM降解的因素显著升高，而对抑制降解的因素没有明显影响。 关于PTX对TIMP-1和MMP-13的影响，不同的实验结果不尽相同。Romanelli等［9］体外研究发现，PTX能明显抑制TIMP-1的mRNA水平，但不影响MMP-1的mRNA水平；而Raetsch等［10］的研究表明，在大鼠胆管结扎模型中，PTX可以显著上调TIMP-1 mRNA水平。我们的实验结果显示 ，治疗组的TIMP-1水平较模型组有所升高，但差异没有显著性，提示PTX对TIMP1的mRNA表达水平没有影响。但这一结果有待于采用较为准确的实时荧光定量PCR方法进一步证实。 参考文献 1中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组. 非酒精性脂肪性肝病诊断标准. 中华肝脏病杂志，2003,11∶71. 2Haruta I, Tokushige K, Komatsu T, et al. Clinical implication of vascular cell adhesion molecule1 and very late activation antigen4 interaction, and matrix metalloproteinase 2 production in patients with liver disease. Can J Gastroenterol，1999，13∶721-727. 3Preaux AM, Mallat A, Rosonbaum J, et al. Pentoxifylline inhibits growth and collagen synthesis of cultured human hepatic myofibroblastlike cells. J Hepatol, 1997, 26∶315. 4Desmouliere A, Xu C, Costa AM. Effects of pentoxifylline on early proliferation and phenotypic modulation of fibrogenic cells in two rat models of liver fibrosis and cultured hepatic stellate cells. J Hepatol, 1999, 30∶621. 5张瑞红,钱绍诚,吕洪敏，等. 己酮可可碱大鼠肝纤维化的实验研究.天津医药,2002,30∶225227. 6熊莉娟, 罗端德, 曾令兰,等. 己酮可可碱对日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏TGFβ1 和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2002, 20∶209. 7Adams LA, Zein CO, Angulo P, et al. A pilot trial of pentoxifylline in nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol, 2004,99∶23652368. 8Koppe SWP, Sahai A, Malladi P, et al. Pentoxifylline attenuates steatohepatitis induced by the methionine choline deficient diet. J Hepatol, 2004,41∶592-598. 9Romanelli RG, Caligiuri A, Carloni V, et al. Effect of pentoxifylline on the degradation of procollagen type I produced by human hepatic stellate cells in response to transforming growth factor β1. Br J Pharmacol, 1997, 122∶1047-1054. 10Raetsch C, Jia JD, Boigk G, et al. Pentoxifylline down regulates profibrogenic cytokines and procollagen I expression in rat secondary biliary fibrosis. Gut, 2002, 50∶241247. 上海《肝脏》杂志社版权 |