【摘要】目的研究高压氧治疗对大鼠肝肺综合征(HPS)的作用。方法采用胆总管结扎术(CBDL)制备HPS动物模型。44只雄性SD大鼠随机分为4组：假手术对照组(Sham组)8只、单纯造模组(CBDL5w组)12只、治疗1周组 (HBOT1w组)12只、治疗2周组 (HBOT2w组)12只。两治疗组在造模成功后送入高压氧舱治疗，分别治疗1周和2周。Sham组和CBDL5w组大鼠在术后5周，HBOT1w组和HBOT2w组在治疗结束后，进行血气分析、肝功能以 及血清一氧化氮(NO)、内皮素1(ET1)浓度检测，肝、肺病理检查，并使用激光多普勒血流仪检测肝、肺微循环。结果CBDL5w组大鼠肝功能检测中ALB降低，ALT、AST、ALP、γGT、TBIL及TBA均升高，血气分析中PaO2降低，PAaO2增大，与Sham组相比均有显著差异(P<0.01)，且病理检查CBDL5w组大鼠的肝脏组织可见胆汁性肝纤维化表现，肺组织可见肺毛细血管扩张、充血，证实HPS大鼠模型制成；同时与Sham组相比 ，CBDL5w组大鼠血清NO及ET1浓度均升高(P<0.01)，肝脏毛细血管血流量降低(P<0.01)，肺脏毛细血管血流量增大(P<0.01)。经高压氧治疗后，HBOT1w组大鼠与CBDL5w组相比，以上指标均好转(P<0.01)。HBOT2w组大鼠与CBDL5w组相比，除血清NO水平和肺脏毛细血管血流量无统计学差异(P>0.05)外，其余指标的差异有显著性意义(P<0.01)。结论高压氧治疗大鼠HPS可通过降低血清NO、ET1浓度，提高组织氧含量及改善肝、肺微循环等，有效改善肝、肺功能及病理，且治疗前期效果更好。 【关键词】肝肺综合征； 胆总管结扎； 高压氧 Experimental study of hyperbaric oxygen therapy in rats with hepatopulmonary syndromeLI Ning, HAO Jianyü, PANG Baosen, LIU Fujia.Department of Gastroenterology, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing 100020, China 【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of hyperbaric oxygen (HBO) on hepatopulmonary syndrome (HPS). MethodsThe HPS model of SD rats was established by common bile duct ligation (CBDL). A total of 44 SD male rats were radomly divided into 4 groups: 8 rats in the sham operated group (sham), 12 rats in model group (CBDL5w), 12 rats in the HBO treated for 1 week group (HBOT1w), and 12 rats in the HBO treated for 2 weeks group (HBOT2w). The rats of two treatment groups accepted hyperbaric oxygen treatment for 1 and 2 weeks respectively after the HPS models established successfully. Then blood gas analysis, liver function, serum NO, ET1 concentrations were detected, pathohistological examinations of lung and liver were performed and microcirculations of lung and liver were measured by Laser Doppler Perfusion Monitor.ResultsComparing with sham operated control group ALT, AST, ALP, γGT, TBIL and TBA levers in liver function of CBDL5w group increased (P<0.01), ALB and PaO2 decreased(P<0.01), PAaO2 increased(P<0.01). The bile canaliculi proliferation and hepatic fibrosis induced by cholestasis could be seen in the liver tissues of CBDL5w group rats pathology, and telangiectasis and congestion in lung tissues. It proved that HPS rats' models had been established. In addition, the concentrations of serum NO, ET1 increased in CBDL5w group (P<0.01), liver priming volume decreased (P<0.01) but increased in lung (P<0.01) comparing with that in control group. Comparing with CBDL5w group, liver functions of HBOT1w group were improved (P<0.01), PaO2 increased (P<0.01), PAaO2 decreased (P<0.01), the concentrations of serum NO, ET1 decreased (P<0.01), liver priming volume increased (P<0.01), the lung priming volume decreased (P<0.01), and the pathology were improved. Comparing with CBDL5w group, the above tested indexes of HBOT2w group were further improved (P<0.01), except that the concentrations of serum NO and lung priming volume were not of statistic significance (P>0.05).ConclusionThe therapy of hyperbaric oxygen in rats with HPS shows benefits to recovery of the liver and lung function and pathology by decreasing the concentration of serum NO、ET1, increasing the tissues oxygen content and normalizing the microcirculation of lung and liver. Moreover, the therapy in early course of the disease is more effective. 【Key words】Hepatopulmonary syndrome; Common bile duct ligation; Hyperbaric oxygen 肝肺综合征(HPS)是指肝功能不全引起肺血管异常扩张，肺气体交换障碍，导致低氧血症及其一系列的病理生理变化和临床表现，在肝硬化中的发病率为5%～29%，目前仍缺乏有效的内科治疗方法。虽然肝移植为治疗HPS最为有效 的方法，但存在手术危险大、供体来源困难、费用较高等问题。为探索临床辅助治疗肝肺综合征的有效方法并为其提供科学的试验依据，我们观测并评价高压氧(HBO)对肝肺综合征大鼠的治疗效果。 材料与方法 一、实验动物 健康成年雄性SD大鼠44只，体重240～280 g，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心。随机分为4组：假手术对照组(Sham组)8只、单纯造模组(CBDL5w组)12只、治疗1周组 (HBOT1w组)12只、治疗2周组 (HBOT2w组)12只。 二、HPS模型制备 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠 (0.15 ml/100 g体重) 麻醉，常规消毒后，沿腹白线以2～3 cm切口开腹，进入腹腔，分离胆总管，Sham组不结扎 即关腹；其余组用4号丝线分别在近肝门处和近十二指肠端双线结扎胆总管后，从中段剪断胆总管，腹腔撒入适量青霉素粉剂以抗感染，关腹，饲养5周。 三、高压氧治疗 两治疗组造模成功后送入DWC 150300型透明纯氧动物实验舱(中国上海)治疗，压力0.2 MPa(2.0ATA)，每次进仓后纯氧洗舱5 min，升压10 min，持续稳压吸氧40 min，减压10 min，然后出仓，每日1次，分别治疗1周和2周。 四、标本采集及项目观测 Sham组和CBDL5w组大鼠在术后5周，HBOT1w组和HBOT2w组在治疗结束后，分别进行各项检测及取材。 (一) 肝、肺微循环检测使用瑞典Perimed AB公司生产的PF5010激光多普勒血流仪(Laser Doppler Perfusion Monitor)检测肝、肺微循环情况 。测量值以相对的灌注量单位(PU)表示。 (二) 血清的采集自腹主动脉取血5～8 ml，离心，取上层血清，分别送检肝功能和NO、ET1。以硝酸还原酶法测定血清NO (试剂盒由南京聚 力生物医学工程研究所提供)，以酶免疫测定法(EIA)检测血清ET1(试剂盒由美国Assay Designs公司提供)，严格按照试剂盒说明进行操作。 (三) 血气分析自腹主动脉取血测定PaO2及PaCO2，并用公式［1］ PAaO2＝150－PaO2－PaCO2／0.8计算PAaO2。 (四) 肝、肺组织形态学检查各组大鼠于采血后，摘取部分肝、肺组织，用10%的甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察其病理变化。 五、统计学处理 使用SPSS 11.5统计软件，数据处理采用两个独立样本t检验或秩和检验，数据结果以±s描述，P<0.05认为有统计学差异，P<0.01为有显著性差异。 结果 一、一般情况 大鼠CBDL术后逐渐出现进食水活动减少，耳尖及尾部皮肤黄染，毛色晦暗、无光泽（营养状况差），大便颜色变浅，腹部较膨隆。造模和/或治疗期间，CBDL5w组死亡3只，HBOT1w组死亡3只，HBOT2w组死亡4只。尸检时可见腹腔内有腹水，淡黄色或淡血色，5～50 ml不等；肝外近端 残留胆管不同程度扩张、胆汁充盈。Sham组大鼠无明显异常。 二、肝、肺组织形态学变化 Sham组大鼠肝、肺组织无明显病理改变。大体观察可见CBDL5w组大鼠肝脏明显增大，色泽灰黄或呈褐绿色，质地变硬，边缘较钝，肝表面弥漫性分布细颗粒状结节。病理检查中，CBDL5w组大鼠肝脏组织光镜下可见汇管区小胆管明显扩张、增生，大量肝细胞变性坏死，残存肝细胞内有 较多胆色素沉积，周围结缔组织增生；肺组织可见肺间质广泛充血增生，毛细血管扩张，扩张的小动脉内膜增厚。与CBDL5w组相比，HBOT1w组和HBOT2w组大鼠的肝、肺病理均有所好转。(见图1～8略) 三、肝功能变化 与Sham组大鼠相比，CBDL5w组的肝功能ALB降低(P<0.01)，ALT、AST、ALP、γGT、TBIL和TBA均升高(P<0.01)。HBOT1w组和HBOT2w组大鼠的以上指标均较CBDL5w组好转(P<0.01)(见表1略)。 四、血氧水平变化 CBDL5w组大鼠与Sham组相比，血气分析中PaO2降低(P<0.01)，PAaO2增大(P<0.01)。HBOT1w组和HBOT2w组大鼠均较CBDL5w组的PaO2升高 (P<0.01)，PAaO2减小(P<0.01)(见表2略)。 五、血清NO和ET-1浓度变化 CBDL5w组大鼠血清NO及ET1均较Sham组升高(P<0.01)。HBOT1w组大鼠较CBDL5w组大鼠血清NO及ET1均下降(P<0.01)。HBOT2w组大鼠较CBDL5w 组血清ET1显著下降(P<0.01)，但两组间NO水平无统计学差异(P>0.05)(见表3略)。 六、肝、肺微循环变化 CBDL5w组大鼠较Sham组肝脏毛细血管血流量降低(P<0.01)，肺脏毛细血管血流量增大(P<0.01)。HBOT1w组较CBDL5w组大鼠肝脏毛细血管血流量增加(P<0.01)，肺脏毛细血管血流量减小(P<0.01)，均趋向正常。HBOT2w组较CBDL5w组大鼠肝脏毛细血管血流量增加(P<0.01)，但肺脏毛细血管血流量无统计学差异(P>0.05)(见表4略)。 讨论 各种类型肝病后期常导致肝硬化，患者可逐渐出现肺脏受累致机体缺氧的表现，而缺氧又进一步加重肝脏损害，其中，肝功能不全引起肺血管异常扩张，引起低氧血症，即称为肝肺综合征。高压氧治疗是一种较新的自然医疗方法，指在超过一个绝对大气压的条件下吸纯氧，从而达到治疗疾病的目的，在现代医学中起着越来越重要的作用。近年来，应用高压氧治疗肝炎、肝硬化等肝脏疾病的临床和实验研究取得了较好的效果。 HPS的诊断主要依靠：(1) 急、慢性肝病，肝功能不全和/或门脉高压；(2)动脉血氧分压减低，在呼吸空气时PAaO2≥15 mm Hg；(3)肺内血 管异常扩张。本实验中，CBDL5w组大鼠肝功能化验、血气分析结果及病理检查与Sham组均有显著性差异，证实CBDL 5周后HPS大鼠模型制成。 同时实验结果显示，高压氧治疗可降低大鼠血清NO、ET1浓度，提高血氧含量并改善肝、肺微循环、病理及肝功能，对HPS有一定的疗效，且治疗前期效果更好。 目前认为HPS发病机制中的肺毛细血管扩张是由于肝功能损伤时血管扩张因子和收缩因子之间的失衡所致，而NO和ET是其中最常见的血管活性物质，它们对HPS的发生、发展起着重要的作用。肝功能受损时，内毒素和某些细胞因子可通过激活NOS基因上的核因子κB (NFκB)调控 作用位点，诱导合成大量NO。正常生理情况下，刺激所引发的内皮细胞ET1与血管平滑肌细胞的ETA受体结合发挥缩血管作用；仅有少量的 ET1通过与内皮细胞上的ETB受体结合，增加eNOS活性和NO量，发挥自分泌血管舒张效应。而目前实验表明，CBDL后，胆管细胞选择性增生 ，产生并释放ET1［2］，同时细菌移位导致肝脏产生的TNFα对ET1的表达进行调节［3］，ET1释放后经血液循环到达肺内，优先与肺血管腔表面内皮细胞的ETB受体结合。另外，HPS时肺内皮ETB受体的表达明显升高，这种效应似乎是由高动力循环和增加的血管切应力造 成的［4］。肝内ET1增加时能诱导激活窦状隙内皮细胞(SEC)和星状细胞(HSC)产生收缩反应使得肝血窦直径缩小，增加肝内血流阻力，导致肝脏微循环障碍，造成门脉高压［5］。 HBO治疗可能通过以下途径减少内源性NO和ET1的产生：(1) 改善门脉高压时胃肠黏膜缺血缺氧、屏障功能受损状态，减少内毒素吸收；(2) 改善肝功能和免疫功能，使网状内皮系统吞噬功能恢复［6］，机体清除内毒素能力增强；(3) 加速胃肠蠕动，抑制肠道细菌繁殖［7］，特别是厌氧菌，使血中内毒素浓度下降；(4) 减弱肠黏膜NFκB的活性［8］，由此减少血中由内毒素及细胞因子诱导的NO的过量产生；(5) 可能 通过减轻肝脏的损害，减少胆管细胞产生并经血液循环至肺的ET1及其与肺血管内皮细胞ETB受体结合所诱导产生的eNOS及NO。 目前认为HPS严重的低氧血症不是肺实质病变引起的，与贫血或腹水抬高横膈影响呼吸功能关系也不大，其发生机制主要为：(1) 氧与血红蛋 白的亲和力降低，使氧离曲线右移；(2) 肺内动静脉和门肺静脉分流，使未经氧合的静脉血混入动脉血中；(3) 通气/血流比例失调，弥 散灌注不良；(4) 肺内血管扩张，使气体弥散距离增加，妨碍肺泡气进入肺毛细血管。而HBO治疗可提高血氧张力，增加血氧含量、组织氧 含量以及组织内氧有效弥散范围，另外，治疗后血清NO、ET1浓度降低，肺毛细血管扩张得到改善，这也降低了气体的弥散距离，因此改善低氧血症。 实验中相对灌注量单位(PU)代表测量范围内平均血细胞移动速率和移动血细胞浓度的乘积。分析认为，治疗后肝脏血流灌注增加与HBO的以下特性有关：(1) HBO影响了血液流变学。HBO治疗可减低血液粘度，改善红细胞弹性和变形能力，减轻红细胞及血小板聚集，改善微循环调节功 能；(2)本实验中HBO治疗降低了内源性ET1水平，减弱了肝内血流阻力。治疗前期HPS大鼠肺脏毛细血管血流量减少，趋向正常，可能与治疗后血清血管活性物质NO、ET1水平下降，扩张的肺毛细血管得到改善（如病理检查所见）有关。 肝硬化时大量纤维结缔组织增生，胶原纤维沉积于肝窦血管壁的内外，使氧弥散距离增加，且HPS患者还存在全身的低氧血症，均导致肝细胞缺血缺氧，进而使肝脏的合成及代谢功能异常。高压氧治疗通过以上降低血清NO、ET-1浓度，提高组织氧含量及改善肝、肺微循环等作用， 使肝脏血氧和各种营养物质的供给大大增加，进而使其合成、代谢及解毒功能等得到改善，肝功能生化指标明显好转。此外，目前认为在常规的高压氧治疗过程中，由于机体内防御系统的清除作用，自由基的增多不会造成组织的损害。 综上所述，HBO可作为HPS的一种可行、有效的治疗方法。但本实验中HBOT2w组大鼠的血清NO水平及肺脏毛细血管血流量较CBDL5w组无统计学差异，显示随病情进展治疗后期的疗效欠佳。 参考文献 1朱元珏，陈文彬，主编．呼吸病学．北京：人民卫生出版社，2003. 415． 2Luo B，Tang L，Zhang J，et al．Biliary epithelial derived endothelin1：an endocrine mediator of experimental hepatopulmonary syndrome．Hepatology，2004，40∶214A． 3Fallon MB．Mechanisms of pulmonary vascular complications of liver disease：hepatopulmonary syndrome．J Clin Gastroenterol ，2005，39∶S138-S142． 4Morawietz H，Talanow R，Szibor M，et al．Regulation of the endothelin system by shear stress in human endothelial cells．J Physiol，2000，525∶761-770． 5Pinzani M, Milani S，De Franco RD，et al．Endothelin1 is over expressed in human 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