【摘要】 目的 在同一载体上串联针对不同靶基因的短发夹状RNA（shRNA），探讨其同时干预不同靶基因的效应。 方法 在已筛选到高效干预靶基因Ku70、Ku80的shRNA表达载体的基础上，构建串联的shRNA表达载体psiRNAKus，该载体能同时表达针对Ku70的shRNA和针对Ku80的shRNA，酶切鉴定和DNA测序确定psiRNAKus构建成功后，将其转染入肝癌细胞株HepG2，转染后48h提取细胞总RNA和蛋白质，RT-PCR和Western blot法检测其干预靶基因的效果。 结果 psiRNAKus表达的shRNAs能够同时抑制Ku70和Ku80在转录水平和翻译水平的表达。 结论 在同一载体上串联的针对不同靶基因的shRNA表达系统有望在实验和临床治疗中得到应用。
【关键词】 RNA, 短发夹状，串联； RNA干扰; Ku70； Ku80
The simultaneous knock-down of Ku70 and Ku80 by a tandem Ku-shRNA-encoding plasmid expression system REN Jing-hua, LIN Ju-sheng, CHANG Ying, WU Ying, ZHANG Ying-hui, ZHANG Qiang, HE Xing-xing. Institute of Liver Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Corresponding author: LIN Ju-sheng, Email: jslin@ tjh.tjmu.edu.cn
【Abstract】 Objective To extend the use of vector-derived siRNA by generating multiple shRNAs in the same plasmid. Methods Construct a vector that expresses shRNAs targeting on Ku70 and Ku80 in tandem. The gene silencing efficiency of each shRNA was verified previously. After identification by restriction digestion and DNA sequencing, the reconstructed plasmid, named psiRNAKus, was transfected into the human hepatoma cell line HepG2. The tandem-shRNA-induced silencing of targeted genes was determined by RT-PCR at RNA level and Western blot at protein level. Results The shRNAs encoded by psiRNAKus down-regulated both the expression of Ku70 and Ku80. Conclusion The vector-derived siRNA delivery system that allows multiple shRNA species to be expressed from the same vector may be of value in experimental and therapeutic applications.
【Key words】 shRNA, tandem; RNA interference; Ku70; Ku80
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象[1]。在植物[2]、真菌[3]、果蝇[4]、线虫[5]、斑马鱼[6]等不同种属的生物体中均可发现RNAi。越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA)来抑制特定基因的表达。siRNA即为一类短片段双链RNA分子，它能够降解同源互补序列的靶mRNA。siRNA作为一种基因沉默手段，由于可以序列特异性地抑制同源序列的表达，具有高效特异且简便易行的特点，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病以及肿瘤的基因治疗。
此前，我们应用siRNA表达载体法制备了针对Ku70的shRNA表达载体psiRNA3、psiRNA4以及针对Ku80的psiRNA5、psiRNA6，并通过RT-PCR和Western blot方法检测到psiRNA不同程度上抑制了靶基因的表达，其中psiRNA4、psiRNA5干扰效果分别比psiRNA3、psiRNA6明显。然而，采用多个质粒共转染同时干预不同基因通常会遇到以下几个方面的问题：转染效率低、表达水平低以及转染时质粒间的相互影响等，而在同一载体上将两个或两个以上的siRNA表达框串联起来形成的多基因共表达载体则有望成为解决这一问题的策略之一。本实验拟构建能同时编码针对Ku70和Ku80的shRNAs表达载体，并检测其对靶基因的干扰作用。
材料与方法
1. 主要材料：人肝癌细胞株HepG2购自中国典型培养物保藏中心，LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，siRNA表达载体的psiRNA-hH1neo购于美国Invivogen公司，Ku70 (A-9)单克隆抗体以及羊源性抗actin抗体均购自美国Santa Cruz公司，纯化的鼠源抗人Ku80单克隆抗体购自B&D公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG以及羊抗兔抗体为美国Pierce公司产品。所有的限制性内切酶均购自德国Fermentas公司，离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天为时代公司。
2．串联shRNA表达载体psiRNAKus的构建：psiRNA4和psiRNA5构建参照psiRNA-hH1neo说明书，psiRNA4和psiRNA5中shRNA编码序列见表1。利用该表达载体中的单克隆位点SpeⅠ和XbaⅠ属于同位酶这一特点，将psiRNA4行ClaⅠ和XbaⅠ双酶切后回收小片段，该小片段则包含有H1启动子序列和shRNA4编码序列。psiRNA5经ClaⅠ和SpeⅠ双酶切后回收大片段，将回收所得的一大一小两片段通过T4 DNA连接酶连接起来所形成的环状DNA载体即为psiRNAKus。
3. 重组质粒psiRNAKus的鉴定：重组质粒分别经HindⅢ单酶切以及ClaⅠ和XbaⅠ双酶切后行15g/L的琼脂糖凝胶电泳。经酶切鉴定后筛选到的可疑重组阳性菌株送往上海生工生物工程公司测序。测序引物位OL381：5′-CCCTAACTGACACACA TTCC-3′。
4. 细胞培养与转染：用含10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5％ CO2的条件下培养HepG2细胞，常规消化传代。参照LipofectamineTM 2000说明书，在转染前1d，将处于对数生长期的HepG2细胞按每孔2×104个细胞接种在6孔培养板中。待细胞融合度为60%～70％时，使用LipofectamineTM2000将构建成功的siRNA表达质粒（psiRNA4、psiRNA5和psiRNAKus）分别转染入细胞中，作为空白对照组的细胞除以培养基代替质粒外，余处理同实验组。每孔质粒 (pmol)∶ TransfectionTM2000 (μl) ≈ 500∶5。转染后4h换上新鲜的完全培养基，继续在培养箱中培养48h，直到目的基因被干预。
5．RT-PCR检测：使用Trizol提取转染质粒后细胞总RNA，逆转录后取部分cDNA行PCR。PCR引物序列设计见表2，PCR循环参数：95℃变性10min；95℃ 45s，适度退火温度40s，72℃ 45s进行30个循环；最后72℃延伸7min。GAPDH作为内参照。
6．Western blot：使用含NP-40三去污裂解液提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，计算含50μg蛋白进行浓度为10%～15%的SDS-PAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2h。分别用抗人Ku70 (A-9)单克隆抗体（1∶1000稀释）、抗人Ku80单克隆抗体（1∶800稀释）、羊源性抗Actin抗体（1∶1000稀释）4℃孵育过夜，TBST洗涤3次（10min/次），加入相应的辣根过氧化物酶标记的第二抗体（1∶2000稀释）37℃杂交1h。化学发光试剂ECL A、B液等体积加到硝酸纤维素膜上，曝光，显影，定影。
7．统计学方法:数据采用SPSS13.0统计软件进行方差分析检验。
结 果
1. 重组质粒psiRNAKus的鉴定：因psiRNAKus重组质粒含两个HindⅢ酶切位点，经HindⅢ单酶切后电泳可见约200bp的短片段和一长约2.8kb的长片段；psiRNAKus经ClaⅠ和XbaⅠ双酶切后行15g/L的琼脂糖凝胶电泳则可见2.6kb的长片段和约400bp的短片段，该酶切结果与预期一致（图1略）。DNA测序结果进一步证实该质粒构建成功。
2. psiRNAKus在转录水平抑制靶基因的表达：psiRNAKus在转录水平干预靶基因效果采用半定量RT-PCR进行检测。psiRNAKus、psiRNA4和psiRNA5不同程度地干扰了靶基因Ku70/Ku80的表达（图2略）。UVP凝胶分析系统分析结果显示：psiRNAKus作用后48h，HepG2细胞中Ku70和Ku80 mRNA分别下降68.41%和65.37%（P< 0.01）；psiRNA4对Ku70 mRNA的抑制率为72.09%(P<0.01)；psiRNA5对Ku80 mRNA的抑制率为76.38%(P<0.01)。
3. psiRNAKus在翻译水平抑制靶基因的表达：psiRNAKus作用HepG2细胞后，Ku70和Ku80蛋白表达的抑制率为58.79%和51.36%（P<0.01）；psiRNA4对Ku70蛋白表达的抑制率为65.98% (P<0.01)；psiRNA5对Ku80蛋白的抑制率为66.47% (P<0.01, 图3略）。
讨 论
肝细胞基因组发生的DNA损伤尤其是DNA双链断裂（DNA double-strand breaks；DSB）与HBV的整合可能存在着某种联系。Petersen等[7]发现氧化应急所致的DNA损伤可以促进HBV DNA整合入宿主基因组，增加DNA损伤位点可显著提高HBV整合的频率。张伦理和Charles[8]在氧自由基诱导DHBV DNA整合及其细胞传代研究中得出以下结论：氧自由基为DHBV整合发生的重要诱因之一，新的整合型DHBV DNA可有较稳定的细胞传代。Dandri等[9]再次证实上述结论。Bill和Summers[10]进一步研究发现：嗜肝病毒DNA整合入宿主肝细胞基因组可能是借助机体非同源末端连接修复DSB的机制完成的。我们知道，DSB是DNA损伤中最为严重的一种类型，引起DSB的原因包括理化因素（如电离辐射）和生物因素（逆转录病毒感染）等[11]。机体为维护基因组的完整性，可启动两种不同的修复途径对DSB进行修复[12]：同源重组和非同源末端连接。这两种修复途径分别有各自的门控基因：同源重组的门控基因是Rad52，而非同源末端连接的门控基因是Ku蛋白[13]。DSB发生瞬间，两类门控蛋白竞争结合DSB断端，从而引发两种截然不同的修复过程。
Ku蛋白是由Ku70/Ku80通过非共价键紧密结合形成的异二聚体结构，人Ku70基因位于染色体22q13， 编码609个氨基酸， 相对分子质量为6.9×104。Ku80基因位于2q33-34， 编码732个AA， 相对分子质量约8.3×104。尽管两亚基有不同的生物化学特性，但是他们很可能起源于同一个基因。Ku70/Ku80异二聚体与DNA依赖的蛋白激酶催化亚单位共同组成DNA依赖的蛋白激酶，参与非同源末端连接修复DNA双链断裂的过程[14]。
我们通过RNAi技术干扰非同源末端连接门控基因的表达，从而使得与Rad52竞争DSB断端的Ku70、Ku80减少，这样机体有可能更大程度上通过同源连接修复DSBs，而借助机体非同源连接末端修复DSB机制的HBV DNA整合则可能被下调。在前一步工作中，我们探讨了siRNA干扰DNA双链断裂修复门控基因（Rad52、Ku70和Ku80）的效果并筛选出高效的siRNA靶位。其中，针对Ku70基因编码区内1318～1338nt的psiRNA4以及针对Ku80基因编码区内831～851nt的psiRNA5编码的shRNAs具有明显的基因沉默作用。
采用载体法达到同时干预多基因表达需克服基因转移效率低这一瓶颈，通过构建多基因共表达载体有望成为解决这一问题的策略之一。本研究结果显示psiRNA4、psiRNA5和psiRNAKus所表达的shRNA都能够不同程度抑制靶基因的表达。比较而言， psiRNA4和psiRNA5对靶基因Ku70、Ku80 的干扰效果较psiRNAKus更为突出，究其原因可能与串联质粒psiRNAKus表达shRNA效率降低有关：由于转录单元相距较近而影响某些转录相关的酶与H1启动子的结合，产生了相互干扰的作用，从而影响siRNA的转录效率。不过统计学分析结果显示组间差异并不显著，且串联质粒psiRNAKus能够实现同时干预Ku70和Ku80表达的目的，这为我们进一步研究HBV DNA的整合与非同源末端连接修复DSB之间关系打下基础，同时也为同一载体串联表达针对不同靶基因的shRNAs的干扰作用提供实验依据。
参 考 文 献
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[3]Nakayashiki H, Kadotani N, Mayama S. Evolution and diversification of RNA silencing proteins in fungi. J Mol Evol, 2006, 63: 127-135.
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张伦理,Rogler CE.氧自由基诱导鸭乙型肝炎病毒DNA整合及其细胞传代研究.中华肝脏病杂志,2000,8:293-295.
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