【摘要】目的研究S-腺苷蛋氨酸（SAM）对人肝细胞和肝星状细胞（HSC）(LX-2细胞株)增殖和氧应激及转化生长因子（TGF）β1表达的影响。方法用不同浓度的SAM培养肝细胞和HSC，用MTT法检测SAM对肝细胞和HSC增殖的影响；用次氮基三乙酸铁（Fe-NTa）和SAM共同培养肝细胞和 HSC，检测超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量；用不同浓度的SAM培养HSC，ELISA方法检测HSC 表达TGF-β1状况。结果在一定 浓度范围内，SAM可抑制HSC增殖，而对肝细胞增殖无影响；SAM可增加肝细胞和HSC的SOD活力，降低其MDA含量，同时可抑制HSC的TGF-β1表达 。结论SAM可抑制HSC增殖，保护肝细胞和HSC免受氧应激损伤，抑制HSC分泌TGF-β1，显示其具有抑制HSC增殖、抗氧化和抗肝纤维化作用。 【关键词】氧应激； 增殖； S-腺苷蛋氨酸； 肝星状细胞； 转化生长因子β1 Effects of Sademetionine on the proliferation, oxidative stress and TGFβ1 expression of human hepatic stellate cellsLIU Mei, LU Lungen, DOU Aixia, CHEN Weihua, ZHENG Ruidan, MAO Yimin, ZENG Minde, FANG Jingyuan.Department of Gastroenterology, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200001,China. Correspondence to: LU Lungen, Email:lungenlu1965@yahoo.com 【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Sademetionine（SAM）on the proliferation, oxidative stress and transforming growth factorβ1(TGFβ1) expression of human hepatocytes and hepatic stellate cells (HSCs)（LX2cell line）.MethodsHuman hepatocytes and HSCs were incubated with various concentrations of SAM, and the effects of SAM on the proliferation of hepatocytes and HSCs was studied by 3 (4,5 dimethylthiazol2yl) 2,5 diphennylterazolium bromide (MTT) colorimetric assay. Human hepatocytes and HSCs were cocultured with SAM and ferric nitrilotriacetic acid（FeNTa）, superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) contents were detected. HSCs were incubated with various concentrations of SAM, the level of TGFβ1 was detected with ELISA.ResultsWithin a given level range of SAM, the proliferation of HSC was significantly suppressed, but the proliferation of hepatocytes was not affected. SAM obviously increased the activity of SOD and decreased the contents of MDA in hepatocytes and HSCs, and inhibited the expression of TGF β1 in HSCs.ConclusionSAM can inhibit the proliferation of HSC, protect hepatocytes and HSCs from oxidative stress, and inhibit the secretion of TGFβ1 in HSCs. 【Key words】Oxidatie stress; Prolifereation; Sademetionine; Hepatic stellate cells; Transforming growth factor β1 腺苷蛋氨酸（SAM）是谷胱甘肽的前体物质，同时是所有甲基化反应的甲基供体，对细胞的生长、分化和发挥功能起到重要的调节作用。临床上广泛应用于治疗肝内胆汁淤积和妊娠期胆汁淤积，可明显改善瘙痒等症状和胆汁淤积的生化指标。不少研究显示，SAM可对抗多种有毒 物质包括酒精、四氯化碳及多种致癌物质对肝脏的毒性作用。本研究以人肝细胞和HSC为研究对象，以铁负载引起细胞损伤，观察SAM对细胞增殖、氧应激和细胞因子的影响，旨在为临床上更好地应用SAM提供理论和实验依据。 材料与方法 一、材料 人肝细胞株张氏肝（chang liver）由中科院上海生命科学研究所细胞资源中心提供，人肝星状细胞株（LX-2）由美国Freidman教授提供。 PRMI-1640培养基和高糖DMEM培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，小牛血清为北京鼎国生物技术有限公司产品，胰蛋 白酶、MTT和二甲基亚砜（DMSO）为美国Sigma公司产品。细胞上清液丙二醛（MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，细胞裂解液超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒WST购自日本株式会社同仁化学研究所，人TGF-β1 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程公司。二氧化碳培 养箱（德国Heraeus公司生产），倒置生物相差显微镜（日本Olympus公司生产），酶联免疫检测仪（芬兰Thermo Labsystems公司生产），紫 外分光光度仪（美国Pharmacia公司生产）。Fe－NTa由0.1 mol/L的FeNO3（Sigma公司）和Na2 NAC（Fluka公司）两种母液混合配制而成， NaHCO3调节pH至7.4，0.22 μmol/L的微孔滤器过滤，现配现用。SAM（商品名思美泰）由雅培制药有限公司提供，存储在4℃冰箱中备用，加 药时用含0.2％血清的培养液配制成浓度为10 mM的母液，0.22 μm微孔滤器过滤，调节pH至7.4，4℃保存，加药前用培养液稀释为各所需浓度 。 二、方法 (一) 细胞增殖实验取对数生长期的肝细胞和HSC，0.25％的胰酶消化后，用含10％血清的培养基配成细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加入 100 μl培养液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。24 h后细胞贴壁良好，换用含0.2％血清的培养基培养，使其生长同步化。再培养24 h 后加入不同浓度的SAM，肝细胞分别设为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mM，HSC设为0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、2.7、3.0 mM，每个浓度设6复孔，同时设空白对照组。继续培养24 h后每孔加入20 μl MTT，置37°C，5％CO2培养箱培养4 h后，弃培养上清液，每孔 加入100 μl DMSO，振荡器振荡10 min后酶联免疫检测仪上570 nm测OD值。 (二) 氧应激实验 1. 检测细胞裂解液中SOD活性：取对数生长期的张氏肝和HSC，分别以5×105/ml和2.5×105/ml接种于25 cm2的细胞培养瓶，每孔5 ml培养液 。待细胞贴壁良好并同步化后，更换培养液并加入不同浓度的SAM，培养2 h后加入FeNTa。分别设空白对照组、模型组和药物干预组，空白 对照组不加任何药物，肝细胞模型组加入500 μM的FeNTa产生氧应激，药物干预组分为500 μM Fe－NTa＋0.005mM SAM，500 μM Fe－NTa ＋0.025mM SAM和500 μM Fe－NTa＋0.125 mM SAM；HSC模型组加入1500 μM的Fe－NTa，药物干预组分为1500 μM Fe－NTa＋0.005 mM SAM， 1500 μM Fe－NTa＋0.025mM SAM和1500 μM FeNTa＋0.125 mM SAM。培养24 h后用刮刀刮下细胞，4°C，2 000×g离心10 min，弃上清。1 ml冰PBS溶液洗净细胞，随后4℃，1 000×g离心10 min，弃上清。重复该步骤一次。在-20℃下放置20 min，再在37℃温浴10 min。重复该步 骤两遍，破碎细胞膜。加入1 ml新的PBS，在4℃，10 000×g下离心15 min。取上清液用PBS稀释，制成样品溶液。用试剂盒检测细胞裂解液中的SOD活性，步骤按试剂盒说明书进行。 2. 检测细胞上清液中MDA含量：分别取相同密度的张氏肝和HSC接种于24孔细胞培养板，每孔培养液为1 ml。置于37℃，5％CO2培养箱中培养 24 h后更换培养液并加入不同浓度的SAM，培养2 h后加入Fe－NTa。分别设空白对照组、模型组和药物干预组，空白对照组不加药物，模型组加入500 μM的Fe－NTa产生氧应激，药物干预组分为500 μM Fe－NTa＋0.005 mM SAM，500 μM Fe－NTa＋0.025 mM SAM和500 μM Fe－NTa ＋0.125 mM SAM，每个浓度设3个复孔。24 h后检测细胞上清液中MDA含量，步骤按试剂盒要求进行。 (三) 检测细胞上清液中TGFβ1取对数生长期的HSC，0.25%的胰酶消化后制成细胞悬液并接种于25 cm2的细胞培养瓶，置于37°C，5％CO2培 养箱培养24 h待细胞贴壁良好后更换培养液并加入低、中、高三个浓度的SAM分别为0.6、0.9和1.2 mM，再培养24 h后，取细胞培养上清液100 μl，用ELISA试剂盒检测TGF-β1含量，步骤按说明书要求进行。 三、统计学方法 所有实验均重复3次，实验数据用结果 一、SAM对肝细胞的影响 (一) MTT法增殖实验在所选的浓度范围内未发现SAM对肝细胞的生长有明显的促进作用。对照组的OD值为(0.538±0.020)，各加药组的OD值为 (0.516±0.040)、(0.525±0.043)、(0.514±0.056)、(0.491±0.029)、(0.550±0.028)、(0.498±0.033)和(0.503±0.073)。各组的OD值与对照组相比无显著差异（P值均>0.05）。 (二) 氧应激实验未加干预的肝细胞SOD活力为(0.525±0.012) U/ml，MDA含量为(1.864±0.197) nM/ml。加入Fe－NTa后使细胞产生氧应激和 （或）脂质过氧化损伤，SOD活力降至(0.346±0.015) U/ml，MDA升高为(11.406±0.766) nM/ml，与对照组相比有显著差异（P值均<0.01）。 预先加入SAM的各组，随着SAM浓度的升高，SOD活力升高较模型组越来越明显，MDA含量的降低亦是如此，呈现一定的量效关系（见表１）。 表1（略） 二、SAM对HSC的影响 (一) MTT法增殖实验对照组细胞生长良好分布均匀，呈长梭形，树枝样突起明显，连接成片几乎占满整个培养孔，OD值为(0.832±0.093)。加入SAM后，在所选的加样量中随着SAM浓度的增加，对HSC的抑制作用逐渐明显，OD值逐渐降低，到3.0 mM时OD值降低为(0.314±0.013)（P值 <0.01）。镜下观察细胞数量较对照组明显减少，且细胞形态逐渐变为短梭形，树枝样突起减少甚至消失。 (二) 氧应激实验与肝细胞的反应相似，Fe－NTa也对HSC产生脂质过氧化损伤，使其SOD活力降低，MDA含量升高（P值<0.01）。与肝细胞不同的是，需要较大剂量的Fe－NTa（1 500 μM）才能使HSC的活力有所下降。预先加入SAM的各浓度组可以不同程度的提高SOD活力，降低MDA含量，且各组与模型组相比有明显差异（P值<0.05或P值<0.01）（见表2）。 (三) TGF-β1实验人HSC可分泌一定水平的TGFβ1。应用一定剂量的SAM后可使HSC分泌的TGFβ1减少，且在所选的浓度范围内随着药物剂量的增加，TGF-β1降低的越来越明显（F值分别为101.69、208.76和1 734.81，P值均<0.01）（见表3）。 表2（略）表3（略） 讨论 SAM是存在于人体所有组织和体液中的一种生理活性分子，它作为生理性巯基化合物如谷胱甘肽、牛磺酸等的前体（转硫作用）和甲基供体（转甲基作用）参与体内重要的生化反应，如对抗氧应激与脂质过氧化、跨膜的物质传递与信号转导等。SAM的前体是一种必需氨基酸即蛋氨酸 ，蛋氨酸必须被腺苷蛋氨酸合成酶（MAT）激活，转变为SAM后才能行使其重要的生理功能。但是在许多肝脏疾病中，MAT的活性显著下降，使蛋氨酸向SAM转化减少，结果造成SAM及其代谢产物尤其是谷胱甘肽等的生物利用度下降，同时还造成高蛋氨酸血症。过多的蛋氨酸表现出毒性 作用，使肝脏ATP降低，其代谢产物如硫醇等在血中浓度升高，使发生肝性脑病的危险度增加。此时补充蛋氨酸是无用的，必须绕过MAT的缺陷，补充反应产物即SAM，才有利于纠正病理状态下的细胞功能［1］。临床上广泛应用于治疗肝内胆汁淤积和妊娠期胆汁淤积，但其作用机制尚 不清楚。 氧应激和脂质过氧化在肝纤维化的形成过程中具有重要作用。有研究证实脂质过氧化可激活HSC，使Ⅰ型胶原mRNA的表达增加［2］，而且细胞色素P450 2E1（CYP2E1）来源的氧化物可促进HSC的增殖和胶原的合成［3］。Wang等［4］的动物实验发现，补充外源性SAM可增加肝脏SAM和 还原型谷胱甘肽水平，并抑制CYP2E1活性和氧应激程度。Wu等［5］用肝细胞作为研究对象，也发现SAM可抑制由花生四烯酸引起的脂质过氧化，并可升高GSH水平。同时有研究发现胆管结扎的大鼠较对照组脂质过氧化物水平升高，还原型谷胱甘肽含量降低，这表明阻塞性黄疸与氧应 激有关［6］。而SAM可减轻这些损伤，表明其作为抗氧化剂有重要的保护肝脏作用。另外，SAM在脑组织也具有对抗氧应激、升高GSH的作用［ 7，8］。本研究采用Fe－NTa分别与人肝细胞和人HSC在体外共同培养，引起铁超载，建立氧应激模型［9］，同时加用不同浓度的SAM处理，检 测细胞内SOD活力及细胞分泌MDA的含量。SOD反映机体清除氧自由基的能力［10］，而MDA是脂质过氧化的重要终产物之一，反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，可促进Ⅰ型胶原mRNA的表达，与HSC增殖和肝纤维化的发生和发展密切相关［11］。本研究结果发现，铁超载引起的 氧应激使肝细胞和HSC的SOD活性降低，MDA含量升高，而一定浓度的SAM可升高肝细胞和HSC的SOD活性，降低MDA含量。这表明SAM可保护肝细胞免受氧应激和脂质过氧化的损伤，同时也可阻断MDA激活HSC，抑制了肝纤维化的发生、发展。最近有研究发现，SAM可阻断HSC表达Ⅰ型胶原和 α平滑肌肌动蛋白，并阻碍HSC DNA的合成，表明SAM可抑制肝HSC的激活、增殖及收缩［12］。我们亦发现一定浓度的SAM可抑制HSC的增殖， 且存在明显的量效关系，更加证实了以上观点。 在肝纤维化动物模型中发现TGF-β1 mRNA水平升高［13］，并且TGF-β1表达升高与Ⅰ型前胶原水平密切相关［14］，这表明TGF－β1是一种促纤维发生的炎症因子。我们发现人HSC可分泌一定水平的TGF－β1，而应用SAM可有效降低TGF－β1水平，从而抑制TGF－β1的一系列促纤维化效应，说明SAM有抗纤维化的功效。Caballeria和MartínezChantar等［15，16］分别从动物实验和临床两个方面证明了这一点。本研究既 发现SAM 可降低TGF－β1，也发现SAM 可抑制铁负荷导致的氧应激，具有抗氧化作用。SAM 使氧应激作用减轻，抑制了HSC的活化，使HSC分泌 TGF－β1减少，表明SAM 的抗纤维化功能部分归功于其抗氧化性。 参考文献 1Lieber CS, Packer L. 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