【摘要】目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型及亚型与YMDD变异的关系，以及前C基因区终止密码变异（A1896）、基本核心启动子（BCP）区T1762/A1764变异在Ba、C1和C2三种基因亚型中的发生情况。方法采用聚合酶链反应－限制性片断长度多态性（PCRRFLP）法对211例服用拉米夫定后发生YMDD耐药变异的患者HBV进行基因型、基因亚型、A1896及T1762/A1764变异检测。结果211份标本中B基因型占50.7％（107/211），C基因型占49.3％（104/211），与广东地区对照人群HBV基因型分布情况相比无统计学差异（χ2=0.508，P=0.476）。进一步亚型分析发现，107份B基因型全部为Ba亚型；C基因型有C1和C2两种亚型，其中C1亚型占64.4％（67/104），C2亚型占35.6％（37/104），与广东地区对照人群C基因亚型分布情况相比也无统计学差异（χ2=0.043，P=0.836）。A1896变异在Ba亚型中的分布最高（41/107，38.3％），C2亚型次之（13/39，33.3％），C1亚型最低（9/65，13.8％），变异在不同基因亚型中的分布有统计学差异（χ2=11.839，P=0.03）。T1762/A1764变异在C1亚型中的分布最高（34/65,52.3％），C2亚型次之(17/39,43.6％)，Ba亚型最低(23/107,21.5％)，T1762/A1764变异在不同基因亚型中的分布有统计学差异（χ2=18.384，P<0.001）。结论HBV基因型及亚型并不影响YMDD变异的发生，但3种基因亚型发生A1896及T1762/A1764变异的模式存在明显不同。
【关键词】乙型肝炎病毒； 基因型； 亚型； 变异 Relationship between hepatitis B virus genotypes/subgenotypes and development of YMDD and precore/core promoter mutations in Chinese patients with chronic hepatitis BWANG Xuegang, WANG Zhanhui, MA Shiwu, LIANG Minfeng, ZHOU Bin, HOU Jin lin.Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV) genotypes/subgenotypes and the development of YMDD mutation, as well as precore stop code (A1896) and basic core promoter (BCP/ T1762/A1764) mutations in Chinese patients with chronic hepatitis B.MethodsHBV genotypes，subgenotypes, A1896 and T1762/A1764 mutations were determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) in 211 chronic HBV carriers with YMDD mutant strain after receiving the treatment of lamivudine.ResultsIn 211 patients, 107 genotype B (50.7%), 104 genotype C (49.3%) were identified, respectively. No statistical difference was found when compared with the distribution of HBV genotypes in Guangdong province (χ2=0.508；P=0.476). Further analysis showed all genotype B belong to subgenotype Ba, 67 with C1 subgenotype (67/104, 64.4%) and 37 with C2 subgenotype (37/104, 35.6%). No significant difference was found compared with the distribution of C1/C2 in Guangdong (χ2=0.043；P=0.836). Prevalence of A1896 was significantly higher in patients with Ba (41/107, 68.3%) than C2 (13/19, 33.3%) and C1 subgenotype (9/65, 13.8%) (χ2=11.839, P=0.03). Development of T1762/A1764 mutations was significantly higher in C1 (34/65,52.3%) than C2 (17/39, 43.6%) and Ba subgenotype (23/107, 21.5%) (χ2=18.384；P<0.001).ConclusionThere was no significant difference in development of YMDD mutation in different genotypes and subgenotypes of HBV in Guangdong provine. But the prevalence of A1896 and T1 762/A1 764 mutations was significantly different in genotypes and subgenotypes of HBV in Chinese patients with chronic hepatitis B.
【Key words】Hepatitis B virus; Genotype; Subgenotype; Mutation
拉米夫定能快速抑制乙型肝炎病毒(HBV)的复制而成为目前临床上普遍用于治疗慢性HBV感染的核苷类似物，但拉米夫定在治疗过程中易产生聚合酶基因区YMDD耐药变异。关于HBV基因型是否影响YMDD变异的发生率，目前仍存在一定争议。与基因型B相比，基因型C感染者可能对拉米夫定治疗后HBeAg的持续应答率偏低，但HBV基因型与拉米夫定耐药突变株的选择和临床进展仍不清楚。
另外,HBV前C区终止密码(A1896)变异与基因型有较强的相关性，基因型A少见而B、D、E及部分C与F型多见。我国流行的HBV基因型主要为B和C型，B基因型进一步可分为Ba和Bj两种亚型，C基因型也可进一步分为C1和C2两种亚型［1，2］，那么A1896变异是否与基因亚型相关，需要进一步研究。HBV基本核心启动子（BCP）区T1762/A1764变异与基因亚型的关系目前还不十分清楚。本研究一方面进一步探讨基因型与YMDD变异的关系，尤其是在我国占主要基因型的B型和C型，以及基因亚型是否对YMDD变异的发生产生影响；另一方面调查A1896、T1762/A1764变异在基因亚型中的分布情况。
材料与方法
一、血清来源和肝炎标志物的检测
实验组血清共211份，均来源于2003—2005年南方医院连续收集的经拉米夫定治疗的住院及门诊患者，所有患者均为广东地区的慢性HBV感染者，且HBsAg阳性持续6个月以上，全部经聚合酶链反应－限制性片断长度多态性（PCRRFLP）法鉴定为YMDD变异阳性，排除重复就诊检测的标本，其中男性186例,女性25例，年龄6～76岁，平均年龄(35.5±11.6)岁。对照组血清共417份，均来自广东地区慢性HBV感染者，所有患者均为HBsAg阳性持续6个月以上。其中男性326例，女性91例，年龄12～71岁，平均（34.2±10.2）岁。诊断标准参考2000年制订的肝炎病毒防治方案［3］。
二、血清HBV DNA提取
取血清50 μl，加入200 μl裂解液（6 mol/L异硫氰酸胍，0.5%SDS，1 mmol/L EDTA）混匀，室温静置5 min，加入250 μl异丙醇, 室温静置5～10 min，12 000×g离心10 min，弃去上清，沉淀用70%乙醇洗1次后溶于20 μl双蒸水中。
三、A1896和T1762/A1764变异检测
取抽提的HBV DNA 3 μl,用PCRRFLP法检测A1896和T1762/A1764变异，按文献所述方法进行［4，5］。先用一对外引物P9（5′-CATAAGAGGACT-CTTGGACT-3′）和Csp（5′-GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA-3′）进行第一轮PCR扩增，再用引物Ce（5′-CAAGCTGTGCCTTGGGTGGCCTT-3′）和Csp扩增前C基因区，产物用Bsu36 Ⅰ内切酶(Promega公司产品)酶切检测A1896变异情况；用引物P9和P11（5′-CTACAGCCTCCTAGTACAATGA-3′）扩增C基因启动子区，PCR产物用BclI 内切酶(Promega公司产品)50℃酶切。酶切产物经3％琼脂糖胶电泳判断变异情况。
四、HBV基因分型
用PCRRFLP法按文献所述方法进行［6］。先用一对外引物BS1(5′-ATGAATTCCCTGCTGGTGGCTCCAG-TTCC-3′) 和S1R(5′-TTAGGGTTTAAATGTATACCC-3′)进行第一轮扩增。再用一对内引物YS1(5′-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3′和YS2(5′-GGGACTCAA-GATGTTGTACAG-3′)进行第二轮扩增。PCR产物经内切酶StyⅠ(Promega公司产品)和BsrSⅠ(Promega公司产品)平行酶切，2％的琼脂糖胶电泳鉴定基因型。
五、基因亚型分析
C基因亚型的分析用PCRRFLP［7］及测序法进行。先用一对外引物964F（5′-ATTAGACCTATTGATT-GGAAAGT-3′）和1272R（5′-AGTATGGATCGGCAG-AGGAG-3′）进行第一轮PCR扩增，再用内引物970F2（5′-CCTATTGATTGGAAAGTATGTCA-3′）和1272R进行第二轮PCR扩增，产物分别用Ase Ⅰ、BstE Ⅱ和 Nci Ⅰ内切酶(Promega公司产品)进行酶切。C1亚型可被Ase Ⅰ和BstE Ⅱ切开，C2亚型可被Nci I切开。经2％的琼脂糖胶电泳确定基因亚型，不能确定亚型者用测序法确定。
B基因亚型的分析用PCRRFLP方法，按文献［8］所述方法进行。先用一对外引物PC1(5′-CATGGCAACTTTTTCACCTCTGCCT-3′)和COR(5′-GAGTGCGAATCCACACTCCA-3′)进行第一轮PCR扩增，再用内引物PC2(5′-TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTG-3′)和COR进行第二轮扩增，PCR产物先用Stu Ⅰ内切酶（Promega公司产品）酶切，不能被Stu Ⅰ内切酶切动的PCR产物，再用Hpa Ⅰ内切酶(Promega公司产品)进行酶切。Ba亚型可被Stu Ⅰ内切酶切开，Bj亚型可被Hpa Ⅰ内切酶切开,酶切产生经2％琼脂糖胶电泳确定。两种酶都不能切动者，PCR产物直接用PC1引物测序以确定其基因亚型。
六、统计分析
统计学分析采用SPSS 13.0，率的比较使用χ2检验。
结果
一、实验组和对照组HBV基因型及亚型分布情况
实验组211份YMDD变异阳性血清中B基因型有107份，占50.7％，C基因型104份，占49.3％。对照组417份血清中，B基因型224份，占53.7％，C基因型193份，占46.3％。实验组和对照组总体基因型分布无统计学差异（χ2=0.508，P=0.476）。经进一步的亚型分析，实验组107份B基因型均为Ba亚型,未发现Bj亚型。对照组224份B基因型也均为Ba亚型。实验组104份C基因型中C1亚型有67份,占C基因型64.4％，C2亚型37份，占C基因型35.6％。对照组193份C基因型中C1亚型有122份(63％)，C2亚型71份(37％)，实验组与对照组相比C基因亚型分布无统计学差异（χ2=0.043，P=0.836）［2］。
二、A1896变异与基因亚型的关系
在211份YMDD变异阳性血清中，A1896变异阳性血清63份，其阳性率为29.9％（63/211）。A1896变异在不同基因亚型中的分布情况见表1。A1896变异在Ba亚型中的分布最高，C2亚型次之，C1亚型最低。变异在不同基因亚型中的分布有统计学差异（χ2=11.839，P=0.03）。
表1（略）
三、T1762/A1764变异与基因亚型的关系
在211份YMDD变异阳性血清中，T1762/A1764变异阳性血清74份，其阳性率为35.1％（74/211）。T1762/A1764变异在不同基因亚型中的分布情况见表2。T1762/A1764变异在C1亚型中的分布最高，C2亚型次之，Ba亚型最低。T1762/A1764变异在不同基因亚型中的分布有统计学差异（χ2=18.384，P<0.001）。
表2（略） 讨论
一些研究发现，HBV基因型之间存在分子生物学特征、临床结局以及对抗病毒药物疗效等方面的差异。在丙型肝炎病毒的研究中，病毒基因型已显示出与临床疗效高度的相关性，基因型分析也已用于指导丙型肝炎的临床治疗［9］。HBV基因型分析是否对乙型肝炎临床治疗具有指导意义也是当前研究的热点。目前临床上应用的抗病毒药物主要有两大类：干扰素和核苷类似物,拉米夫定是胞嘧啶核苷类似物，也是目前使用最广泛的抗病毒药物之一。但在治疗过程中易产生聚合酶区氨基酸序列YMDD变异而引起病毒耐药，患者血清中HBV DNA和转氨酶水平重新升高，少数患者还会出现病情加重，导致抗病毒治疗失败。因此，本研究设计主要在于探讨HBV基因型与拉米夫定抗病毒治疗后YMDD变异发生率之间的关系，为临床治疗提供具有实际参考价值的信息。
调查显示，拉米夫定治疗1年基因型A发生YMDD变异的概率较高，但随着治疗时间延长至2～3年，基因型A和D之间YMDD变异的发生率无区别，提示基因型D可能需要较长的时间出现YMDD变异［10］。关于基因型B和C与YMDD变异的关系，香港的一项调查显示，82例患者经拉米夫定治疗半年和1年后，YMDD变异的发生率B型和C型之间无差异［11］。日本的一项研究调查213例接受拉米夫定治疗的患者，包括基因型A、B和C，治疗1年后三者之间无差别，但Ba亚型YMDD变异的发生率明显高于Bj亚型［12］。国内部分研究结果认为基因型B和C与YMDD变异发生无关［13］，而有些则认为基因型与耐药变异发生有关。我们曾对发生YMDD变异的42例HBV感染者研究发现，B基因型和C基因型在YMDD变异的发生率及变异方式上无明显差别，而出现YMDD变异后C基因型患者HBV DNA水平上升较B基因型患者更高［14］。在本研究中，我们发现基因型B与基因型C之间YMDD变异发生率无明显差异，同样的结果也出现在基因亚型之间，这与前述结果大致相符。是否将基因型或亚型用于临床疗效的评估指标还需要进一步研究。根据本研究结果，基因型及亚型并不能作为拉米夫定治疗过程中YMDD变异发生与否的预测因素，基因型及亚型并不影响YMDD变异的发生率。
一些研究显示，HBV基因型与多种病毒变异方式存在着一定的依从关系。例如前C区A1896终止密码子变异在各基因型有显著差异［15］。基因型B、D、E及部分C、F基因型较易出现前C区A1896变异，而在基因型A则很少发生。这种基因型特异的变异产生基础在于前基因组mRNA 的包装信号区形成ε结构，在该结构中，第1858位核苷酸与第1896位核苷酸形成碱基配对，基因型A的nt1858为C，能与nt1896的G形成稳定的碱基配对，而基因型B、D、E及部分C、F的nt1858位为T，不能与nt1896位的G形成稳定的碱基配对，如果nt1896的G突变为A后则可稳定碱基配对，因此在这些基因型中前C区终止密码变异的发生率较高，而A基因型的终码变异发生率低。关于T1762/A1764变异与基因型及基因亚型关系的研究目前报道较少。两个来自亚洲人群的报道指出，基因型C较基因型B更易发生C基因型启动子T1762/A1764变异,而在基因型B的两个亚型中，Ba又较Bj更易出现C基因型启动子T1762/A1764变异［8］。
在本研究中，前C区A1896变异的发生率Ba亚型最高，C2亚型次之，C1亚型最低，且三者之间变异的发生率有明显统计学差异。而C基因启动子T1762/A1764变异的发生率C1亚型最高，C2亚型次之，Ba亚型最低，三者之间有明显统计学差异。A1896变异后使HBeAg的翻译过程提前终止，因此血清中检测不到HBeAg；而T1762/A1764变异会影响前C基因启动子区核苷酸与转录因子的结合，影响前C mRNA的转录，进而影响血清中HBeAg的量，因此T1762/A1764变异也是导致HBeAg阴性的重要原因之一。对于A1896变异发生率较高的Ba亚型和C2亚型，病毒在与机体相互作用过程中可能容易选择A1896变异而出现HBeAg阴转，因此T1762/A1764变异的发生率较低，而对于A1896变异发生率较低的C1亚型，病毒则通过T1762/A1764变异的方式来达到HBeAg阴转。
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上海《肝脏》杂志社版权
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