【摘要】目的研究原发性肝癌患者乙型肝炎病毒（HBV）基因型、亚型和突变的地区性差异。方法HBV阳性的原发性肝癌组织标本80例，其中广西地区20例，上海、浙江、江苏（长三角地区）60例。应用聚合酶链反应（PCR）扩增患者携带的HBV DNA序列，PCR产物直接纯化测序。用NCBI在线的软件viral notyping tool确定HBV基因型，MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis, version 3.1）软件构建系统进化树和进行亚型分型及突变分析。结果80例肝癌标本中，17例为B基因型(21.3%)，57例为C基因型(71.3%)，6例为B、C基因型混合感染(7.5%)。对17例B基因型和57例C基因型的亚型分型，其中B基因型的亚型全部为B2型，Ｃ基因型的亚型有Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５等三型，其中有１２例为Ｃ１型(21.1%)，44例为Ｃ２型(77.2%)，１例为Ｃ５型(1.8%)。广西地区的C1亚型35%(7/20) 明显高于长三角地区的Ｃ１亚型8.5%（5/60），而广西地区的C2亚型20%(4/20) 明显低于长三角地区的Ｃ2亚型66.7%（40/60）。两地区HBV基因亚型分布在统计学上有显著差异。比较两地区的HBV序列还发现，广西地区B基因型CP区T1762/A1764呈现更高的突变性，有6例（100％）存在突变，而长三角地区只有2例（16.7%）。 结论两地区原发性肝癌患者的HBV亚型分布和基因型B的CP区T1762/A1764突变率有显著差异。
【关键词】肝炎病毒，乙型； 基因型； 亚型； 突变 Genotyping and mutation analysis of hepatitis B virus in hepatocellular carcinoma patients from different areas in ChinaHUANG Minghui, QIN Wenxin, ZHANG Ping, YAO Genfu, GU Jianren.Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China
【Abstract】ObjectiveTo study hepatitis B virus (HBV) genotype and mutation in hepatocellular carcinoma (HCC) cases in Guangxi area and Changsanjiao area.Methodswe used PCR to detect HBV genotype of 80 HBVinfected HCC cases from two areas including 20 cases from Guangxi area and 60 cases from Changsanjiao area (Shanghai, Zhejiang, Jiangsu). Data were analyzed by NCBI online software viral genotyping tool and phylogenetic tree of HBV sequences constructed by MEGA (version 3.1) software.ResultsAmong 80 HBVinfected HCC cases, the prevalence of genotype B,C, and B/C were 21.3%(17/80)，71.3% (57/80) and 7.5% (6/80), respectively. In genotype C, 12 cases were subtype C1（21.1%), 44 cases were subtype C2 (77.2%), 1 case was subtype C5 (1.8%). In genotype B, all cases were B2. In Guangxi area, the prevalence of subtype C1，C2 were 35% (7/20) and 20% (4/20). In Changsanjiao area, the prevalence of subtype C1,C2 were 8.5% (5/60) and 66.7% (40/60). The HBV subtype C1, C2 distribution of two area exhibited significant differences in the HBVinfected HCC cases. In addition, the T1 762/A1 764 mutation of two areas exhibited significant differences in genotype B, in Guangxi area, the prevalence of mutation in genotype B was 100％ (6/6), and in Changsanjiao area, the prevalence was 16.7% (2/11).ConclusionHBV subtypes B2, C1, C2, C5 distribution and BCP mutation in genotype B showed significant differences between HBVinfected HCC cases of two areas.
【Key words】Hepatitis B virus; Genotype; Subtype; Mutation
乙型肝炎病毒（HBV）感染是亚洲地区肝癌患者最常见的致病因素［1］。在众多影响HBV感染后转归的因素中，HBV基因型及基因突变起着重要作用［2］。根据HBV DNA全基因组序列差异大于8%或S基因区序列差异大于4%进行分型的标准，可分为A、B、C、D、E、F、G和H 共8个基因型［3-6］。根据HBV DNA全基因组序列的差异还可将基因型B和C分为基因亚型B1～B5和基因亚型C1～C5［7，8］。HBV发生基因突变频繁，研究证实HBV基因核心区启动子（CP）区突变最常见A1762T和G1764A突变，这种突变可减少前C区和C区的mRNA转录，亦是HBeAg阴性慢性乙型肝炎产生的原因之一［9，10］。相对于基因型B，CP区突变多见于基因型C中，研究发现CP区突变与基因型C和肝癌有关［11］。HBV基因型分布具有地域性，在以B型和C型为主的亚洲地区，有研究发现在HBV无症状携带者、慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌患者中，C基因型所占比例依次增大，B型则相反［12］。因此深入研究HBV基因型、亚型和CP区突变对了解HBV对肝癌的影响有重要意义。
材料与方法
一、组织标本
80例肝癌组织标本采自1998—2005年。其中广西肿瘤防治研究所提供20例，浙江大学医学院附属第一医院提供31例, 启东肝癌研究所18例, 第二军医大学东方肝胆外科医院研究所11例。患者乙型肝炎表面抗原阳性，临床诊断为肝细胞癌。采集的标本放置于-80℃保存。患者的各项生化指标检测与诊断符合2000年病毒性肝炎防治方案标准。
二、试剂和仪器
PCR酶体系 Advantage (r) 2 PCR Enzyme System 购自Clontech公司。dNTP购自上海生工生物技术公司。PCR产物回收试剂盒购自美国OMEGA公司。DL2000 分子量标记物（北京天根生物科技公司），琼脂粉（日本进口分装），ABI公司的9700 型PCR热循环仪。大型高速离心机为美国SORVALL公司的 RC 6。将HBV全基因组分为有重叠的S、SX、CX、SC四个区段设计引物，引物设计参考文献［13］，送上海invitrogen公司合成。引物序列见表1。表1（略）
三、HBV基因型与亚型的分型
肝癌组织样本提取参照《分子克隆》的酚-氯仿法抽提。HBV扩增用巢式PCR法，反应体系50 μl, (含10×PCR缓冲液5 μl，50×Advantage 酶体系1 μl，10 mM的dNTPs 1 μl, 10 μM的每个引物各1 μl，100 ng/μl的HBV DNA模板1 μl，反应条件：预变性94℃ 3 min,然后94℃ 1 min,68℃ 3 min，35个循环后72℃ 7 min。取第一轮的产物为模板进行第二轮扩增，体系和反应条件与第一轮相同。取第二轮的产物在150 V电压下经10 g/L琼脂糖凝胶电泳15 min，用OMEGA公司的胶回收试剂盒回收PCR产物，回收产物直接送上海桑尼生物科技公司（ABI3730自动测序仪）测序。用NCBI的在线的viral genotyping tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)确定HBV基因型， MEGA（version 3.1）构建系统进化树及进行亚型分析和突变分析。构建系统进化树的具体方法和参考序列参照文献［7］，序列提交采用CLUSTAL W（1.6）。亚型C5的确认，除了采用以上传统的方法外，还采用了NCBI的在线软件MegaBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)查找高度同源序列，在线采用Distance tree of results 中的邻位法（NeighborJoining）构建系统进化树和进行亚型分析。
四、统计分析
采用stata 8.0软件进行χ2检验。
结果
一、HBV基因型和亚型的分型结果
根据每个区段测序的结果，用NCBI的在线软件viral genotyping tool确定HBV基因型以及B/C的混合感染。每个区段取850个碱基进行HBV基因型分析, 确定HBV基因型。以CX区段（nt1355～nt2135）序列用MEGA（version 3.1）构建系统进化树及进行亚型分析。构建系统进化树分析出HBV的亚型。在80例HBV感染的肝癌患者中，57例为C型的感染，18例为B型感染，6例为B、C的混合感染，其次为B型感染。对18例B基因型和57例C基因型的亚型分析来看，其中B基因型的亚型全部为B2型，Ｃ基因型的亚型有Ｃ１、Ｃ２和Ｃ５三型，其中有４４例Ｃ２型，１２例为Ｃ１型，１例为Ｃ５型。其他基因型如A、D、E、F、G、H没有在本研究中发现。两地区的基因亚型分布在统计学上有显著意义，广西地区的C1亚型35%(7/20) 明显高于长三角地区的Ｃ１亚型8.5%（5/60），而广西地区的C2亚型20%(4/20) 明显低于长三角地区的Ｃ2亚型66.7%（40/60）（见表2）。表2（略）
二、HBV亚型Ｃ５型
确认C5亚型，除采用MEGA（version 3.1）构建系统进化树进行亚型分析外，还应用NCBI的MegaBlast，使用HBV序列查找高度同源序列，作在线的系统进化树分析和同源分析（见图1略）。采用MEGA（version 3.1）构建系统进化树进行亚型分析时, 对S基因、P基因、X基因、C基因的序列分别构建系统进化树,均显示这一来自广西河池市的病例为C5型。(A)对广西地区肝癌患者G31的HBV序列用MEGA(version3.1)构建系统进化树(bootstrap重复1 000次)，显示G31（箭头所指的位置）肝癌患者的基因亚型为C5型。(B)用NCBI的在线的MegaBlast方法分析，显示G31（三角形所指的位置）的基因亚型为C5型。其他的5条参考序列为C5型。（图1略） 三、两地区间的HBV 基因突变的比较
在广西地区和长三角地区肝癌患者肿瘤相关因素中，选取年龄和CP区突变进行比较。发现广西地区肝癌患者的发病年龄比长三角地区低, 两地区HBV的CP区T1613、T1653、M1753、T1762/A1764等5个位点的突变情况无显著差异（见表3）。但对基因型B分析发现广西地区有6例（100％）存在T1762/A1764突变，长三角地区病毒基因型的T1762/A1764位点突变2例（16.7%），两者在统计学上有显著差异。而T1613、T1653两位点的突变率，广西地区均较长三角地区低，但无统计学差异（见表4）。
表3（略）
表4（略） 讨论
研究表明，我国主要以HBV 基因型B和C感染为主，也有D和B、C型的混合感染。葛宪民等［14］报道广西地区的HBV基因型B占21.7%,基因型C占72.7%。Ding等［15］报道上海地区HBV基因型B型占17.2%，C型占81.4%。谢琴秀等［16］报道江苏省HBV基因型B 占33.5%,基因型C占61.4%。肖扬等［17］报道浙江部分地区的HBV基因型B占20. 49%，C型66. 46%。以上结果表明，广西地区与长三角地区的HBV感染以C型为主，其次为B型，其他类型少见。本研究发现，在这些地区HBV 感染的肝癌患者中以C型感染为主（71.2%），其次为B型感染(21.3%)，没有发现其他型。从病毒基因型的亚型来看，有B2、C1、C2和C5的分布,其中Ｃ１型主要分布在广西，这表明在我国的南方地区存在C1型的分布，这与以前的研究是一致的［18］，而C5型在广西分布则鲜见报道。C5主要分布在菲律宾、越南等地，而我国是否仅广西有C5型的分布尚待研究。广西是我国肝癌高发的省份之一，从病毒基因型的分布看，有B2、C1、C2、C5型，需要对该地区病毒亚型与临床的关系进行更深入的研究。在本研究中，我们采用PCR产物直接测序的方法，可能会漏掉HBV混合感染中的次要类型，因此发现的混合感染率不高。但我们对每个样本分为4个区段来测，用每个区段的序列分析其基因型，其结果可正确反映病毒感染的主要类型。
本研究发现，肝癌患者中基因型B的CP区T1762/A1764变异有地区差异, 其在广西地区的变异率高，而长三角地区较低。就总体而言，两地区的CP区T1762/A1764变异均较高。CP区T1762/A1764变异可使前基因组RNA转录及病毒的包装功能增强,病毒的复制水平提高［1921］。CP 区T1762/A1764变异与基因型C和肝癌的发生应有一定的相关性［11］。但比较CP区变异时需将基因型和不同地区来源考虑在内，对基因型B的CP区T1762/A1764变异是否有地区差异，尚需更多的研究才能确定。
不同地区来源的HBV基因型和亚型分布具有较大的差异，可影响HBV的生物学特性和临床特点。广西地区肝癌患者基因型和亚型的分布及基因型B的HBV CP区突变与长三角地区肝癌患者具有不同的特点，广西地区的HBV基因型C以C1亚型为主，有C5亚型的分布，这可能对地区性肝癌高发的机制产生一定的影响。
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