【关键词】 分离和提纯； 细胞培养，方法; 人肝星状细胞 An effective method of isolating and culturing human hepatic stellate cells ZHANG Wen-wei, XU Lie-ming. 【Key words】 Isolation and purification; Cell culture techniques; Human hepatic stellate cells 【First author抯 address】 Institute of Liver Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China Corresponding author: XU Lie-ming, Email: xulieming@126.com HSC是细胞外基质的主要合成细胞。从人肝组织中分离培养HSC，用于中药药理研究，可以得到与人体内相接近的实验结果，从而增加实验数据的可信度。我们成功分离培养了人肝星状细胞（H-HSC），报道如下。 一、材料与方法 1. 材料：（1）人肝脏组织：取肝移植手术弃肝中肝组织相对正常部分（重约50～100g）。由上海市第一人民医院、仁济医院（东部）、中山医院消化外科、瑞金医院肝脏移植中心提供。肝组织用UW器官保存液保存，置于0℃冰水中。（2）主要试剂：链酶蛋白酶，Ⅰ型DNA酶（DNaseⅠ），德国Roche公司产品；Ⅳ型胶原酶，德国Serva公司产品；无钙低限量基础培养基（MEM）培养基干粉，M199培养基干粉，美国Gibco公司产品；Nycodenz，挪威Axis-Shield公司产品；小牛血清（NBS），结蛋白兔多克隆抗体，α-平滑肌肌动蛋白[（α-SMA）Ab-7（Clone B-4）]鼠单克隆抗体，胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）Ab-1鼠单克隆抗体，均为美国NeoMarkers公司产品，标记的牛抗鼠抗体，美国Santa Cruz Biotechnology公司产品，CYTM5荧光标记的山羊抗兔抗体，美国Zymed公司产品；长效抗退色封片试剂盒，美国Molecular Probes公司产品。（3）分离和培养用溶液：前灌流液、酶配制液、汉可氏平衡盐溶液（HBSS）溶液、D-Hanks液，加超纯水定容至终体积1000ml，pH≈7.2。链酶蛋白酶溶液（高浓度）：链酶蛋白酶0.4g，酶配制液100ml，pH≈7.2。胶原酶溶液（Ⅳ型胶原酶）0.025mg，酶配制液225ml，pH≈7.2。链酶蛋白酶溶液（低浓度）：链酶蛋白酶0.03g，酶配制液50ml，pH≈7.2。DNase酶溶液：DNase I 6mg，酶配制液30ml，pH≈7.2。28.7% Nycodenz溶液，搅拌>1h，4℃，pH≈7.3。MEM培养液、M199细胞培养液，超纯水定容至终体积1000 ml，pH≈7.2。HBSS A液，0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四醋酸（EDTA）消化液，以上溶液均灭菌过滤。（4）主要仪器设备：纯水系统，美国Labconco公司制造；18G留置针，购自上海卫生技术设备公司；Heraeus Varifuge 20 RS低温高速离心机、CO2培养箱、HEALFORCE生物安全柜，德国Heraeus公司制造；倒置显微镜（37×B），上海生产；激光扫描共聚焦显微镜（TCS SP 2），德国Leica公司产品。 2. 方法：（1）H-HSC的分离培养：将前灌流液、链酶蛋白酶溶液（高浓度）、胶原酶溶液、链酶蛋白酶溶液（低浓度）预先置于37℃水浴中。然后将肝脏组织放入温育的前灌流液中，戴无菌手套在37℃水浴里的器械盘中操作。注射器接18G静脉留置针套管，寻找肝组织上血管断口，反复注入前灌流液，使肝组织中血液尽可能被冲洗干净。弃去前灌流液，倒入链霉蛋白酶（高浓度）溶液，在37℃水浴中如上法，反复灌注，约20min，直至肝组织颜色变淡，呈淡土黄色，质地变软。弃去链霉蛋白酶（高浓度）溶液，倒入胶原酶溶液，在37℃水浴中，反复上述操作，约25min，直至肝组织接近液化。在100mm的培养皿中，将消化后的肝组织用镊子撕碎，倒入硅化三角烧瓶，加DNase酶溶液（4℃预冷）5ml，链霉蛋白酶（低浓度）溶液30ml，用MEM溶液定容到100ml，在37℃水浴振荡器中振荡（200r/min，30min）。振荡结束后，将肝组织悬液通过覆盖两层纱布的漏斗过滤到2根50ml聚丙烯离心管中，每管40ml。瓶中遗留细胞悬液加DNase酶溶液3ml和MEM 25ml，在磁力搅拌器中中速搅拌后，用覆盖两层纱布的漏斗过滤到1根50ml聚丙烯离心管中，用4℃预冷的MEM溶液加满后离心（1900r/min，10min）。用MEM溶液离心洗涤3次，在最后一步离心过程中，将细胞合为1管，小心吸弃上清液至余细胞液为8ml左右，加DNase酶溶液2ml，MEM溶液4.15ml，充分混匀后，加入28.7% Nycodenz溶液和MEM液，充分混匀细胞悬液（共40 ml），平均分至两个50ml离心管中。小心地在细胞悬液上铺加一层HBSS A液与MEM溶液的混合液（1∶1）10ml，4℃，2500r/min，22 min，梯度离心。垂直位取下离心管，仔细吸取混合液与细胞悬液界面之间的细胞层，入50ml离心管中，用4℃预冷的MEM溶液加满后，4℃，1900r/min，离心10min。弃上清液，以含有20% NBS的M199培养液悬浮细胞。取90μl细胞悬液加10μl 0.4%台盼蓝溶液在倒置相差显微镜下观察细胞的数量和活力。将细胞以适宜的浓度接种于直径为100 mm或60 mm培养皿中，置于37℃、体积分数5% CO2、95%潮湿空气的CO2培养箱中培养。24h后培养液更换为M199培养液，培养7d，中间换液1次。当原代细胞生长到接近铺满培养皿底后，吸去培养液，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液消化细胞3～5min，吹打细胞离壁后，收集消化液装入含有10% NBS M199培养液50ml的离心管中终止消化，1900r/min，4℃，离心10min。用含10% NBS M199培养液悬浮细胞，接种于直径100mm或60mm塑料培养皿中，体积分数5% CO2、95%潮湿空气、37℃培养箱中培养，每3～5d更换1次培养液。（2）H-HSC的性质鉴定：将HSC接种于事先放有玻片的12孔培养板中进行培养。分别收集原代培养第1、4天和第7天的玻片，用镊子小心将培养板中的玻片取出，每个时间点均收集玻片5张，用预冷的PBS洗3遍，吹干后，将玻片放入甲醇∶丙酮（1∶1）的固定液中固定，4℃，过夜。将玻片从4℃冰箱取出后，用缓冲液B洗3遍后，缓冲液C室温下，温育15min。缓冲液B冲洗3遍后，3%山羊血清（用缓冲液B配制）室温下，温育30min～1h。随后分别向每个时间点的玻片中加入抗结蛋白抗体、抗α-SMA抗体、抗GFAP抗体、抗结蛋白+抗α-SMA抗体或抗结蛋白+抗GFAP抗体（均为1∶200，稀释在缓冲液C中），37℃，温育2h后，用缓冲液B冲洗3遍，加入抗鼠IgG (H+L) FITC，或抗兔IgG (H+L) CYTM5，或抗鼠IgG (H+L) FITC+抗兔IgG (H+L) CYTM5，37℃，温育1h。缓冲液B冲洗3遍后，用长效封固剂和长效抗退色试剂混合物封片，4℃，避光保存。在激光扫描共聚焦显微镜下观察并摄片。 二、结果 1. H-HSC的得率和纯度：成功的从小块人肝脏组织中分离出了H-HSC，通常每50g的肝脏组织中分离得到的H-HSC得率约为1×107个，80～100g的肝脏组织中H-HSC得率约为2×107个。以0.4%台盼蓝染色，细胞存活率在98%以上。由于分离的条件不如大鼠可控，故细胞的纯度略低于大鼠，约80%。 2. H-HSC的形态：在相差倒置显微镜下可见初分离得到的H-HSC呈圆球状、细胞质透亮且内含丰富黑色折光的脂滴颗粒，体积小于肝细胞，大于库普弗细胞。接种24h后，细胞开始贴壁生长，呈扁圆或梭形，细胞质内脂滴明显，部分细胞已开始向外伸展。原代培养4d的H-HSC，大部分已向外伸展出细长伪足，形态和伪足长短各异，呈现出星状及多种不规则形态，见图1。原代培养7d后，细胞质中的脂滴逐渐减少甚至消失，细胞呈片状伸展，伪足很长，胞内可见细丝状结构，可见新增殖分裂的细胞，见图2。H-HSC传代后1h左右，细胞均已贴壁，24h后细胞全部生长，呈大片状伸出伪足，细胞质中脂滴已基本消失，出现许多细丝状结构，见图3。 3．H-HSC性质鉴定：我们对原代培养1、4、7d的H-HSC做细胞免疫荧光染色，发现H-HSC内结蛋白的表达均为阳性，α-SMA和GFAP在培养第1天未见表达，培养4、7d时表达明显增加（图4）。我们还对原代培养1、4d和7d的H-HSC进行免疫荧光双染色。观察到：原代培养1d H-HSC内结蛋白表达明显，α-SMA和GFAP未见表达，原代培养4d H-HSC内结蛋白表达呈阳性。α-SMA和GFAP的表达明显，细胞伸展出伪足，α-SMA组H-HSC可见丝状结构，原代培养7d的H-HSC内结蛋白表达仍然呈阳性。α-SMA和GFAP的表达较第1天明显增加，与第4天相比无明显差别，仍维持高水平表达。α-SMA组H-HSC出现许多细丝状结构。 三、讨论 H-HSC分离和培养的成功为最接近于人体条件的实验研究提供了平台。我们在美国Friedman实验室的技术支持下，在国内首次成功分离并培养了原代H-HSC，为更加深入地探讨肝纤维化作用机制及其研制治疗中药奠定了基础。 我们将分离出的H-HSC在体外未包被的塑料培养皿中原代和传代培养。从形态上来看，随着培养天数的改变，细胞逐渐活化并开始向MFB转变。原代培养1d的H-HSC多呈圆形，内含黑色高折光度的维生素A脂滴。与大鼠HSC相比，细胞体积略大，脂滴较少；原代培养4d的H-HSC开始增殖，形态也开始发生改变，细胞伸展出多样的伪足，形态各异，细胞质内含的脂滴减少；原代培养至第7天，细胞数量增多，已呈现肌成纤维细胞样细胞改变，细胞形态呈片状，胞内细丝状结构明显；传代后的H-HSC生长迅速，胞内几乎看不到脂滴，贴壁24h后即分裂，细胞呈大片状伸展，胞内细丝状结构丰富。我们对1、4d和7d的H-HSC进行免疫荧光双染色，发现H-HSC和大鼠HSC所表达的性状特征相类似，能够表达出HSC典型的细胞骨架微纤丝。结蛋白主要功能是使肌纤维连在一起，是确定HSC的特定标志物[1]。在正常大鼠的HSC内有大量结蛋白表达。α-SMA是平滑肌肌动蛋白，当HSC受到刺激和向MFB转变时，会发生表型和功能的改变，可高度表达α-SMA[2]。胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）是一种胶质原纤维酸性蛋白，起支撑作用[3]。在活化的大鼠HSC和大鼠及人的HSC系中有大量的GFAP表达，将GFAP和α-SMA同作为H-HSC活化的标志物[4]。在原代培养1、4d和7d的H-HSC内结蛋白表达均呈阳性。在原代培养1d的H-HSC内观察不到α-SMA和GFAP的表达，H-HSC内还富含着大量的脂滴；随着H-HSC的逐渐活化，4d和7d的H-HSC内脂滴减少，α-SMA和GFAP的表达开始明显增加，表明H-HSC开始逐步活化并向MFB转变。我们成功分离培养了H-HSC，经鉴定符合HSC的形态特征，得率和纯度能满足实验的需求。 人与大鼠的HSC分离方法相类似，由于无法采用活体门静脉穿刺的原位灌流消化方法，故只能完全依靠手工操作进行。因此，消化火候的把握至关重要。此外，人肝脏组织的取材部位、血管走向各不相同，无法象分离大鼠HSC时那样，在肝脏灌流前将血液完全冲洗干净。如果未冲净血液的肝组织体积较大，细胞得率和纯度都将很低，故H-HSC的得率和纯度在很大程度上与肝组织的取材部位密切相关。切取的肝组织要大小适中，并非组织越大越好，而要尽量靠近肝脏的边缘，以肝组织三面均保留完整肝脏包膜为最佳。H-HSC分离成败的最关键环节在于链酶蛋白酶对细胞的消化。不同人的肝脏组织取材大小不等，质地软硬程度不同，因此不能准确地用时间来衡量肝组织消化的程度，消化时间只能作为参考。适宜的消化程度依靠操作者的感觉和经验来决定。一般肉眼观肝脏组织块已肿胀、颜色变淡呈淡土黄色；用手指直接感触，肝脏组织已经变软。如消化得不够充分，一方面肝组织很难用镊子撕碎，最终导致整体的细胞得率都很低；另一方面会导致大量的肝细胞存在，也严重影响HSC的得率和纯度。然而，并不是消化的时间越长HSC就越多，如消化过度反而会损伤HSC，影响细胞的成活，导致细胞接种后不贴壁或贴壁数量较少；或在培养的过程中细胞生长不良，活力差，较长时间处于静止状态，甚至出现越长越少的现象。由此可见，适度地把握住链酶蛋白酶对细胞的消化，在整个H-HSC的分离过程中具有举足轻重的地位。我们在经过多次摸索之后，确定了链酶蛋白酶的用量、作用时间及消化时所适宜的温度。一般50g左右的肝脏组织所需链酶蛋白酶的用量为400mg（如肝脏组织稍大于50g，则无须增加酶的用量，可适当延长消化时间），消化时间约20min，消化时的温度恒定在37℃。如肝脏组织消化适度，在密度离心前，可见离心管中剩余的肝细胞很少；密度离心后，细胞中夹杂的肝细胞亦极少。在链酶蛋白酶对细胞进行消化之后，还需采用胶原酶来消化肝组织中的一些结缔组织，直至肝组织接近液化，消化时间约25min，温度恒定在37℃。根据肝组织的大小可适当延长消化时间。 志谢 上海市第一人民医院彭志海主任和仁济医院东院夏强主任及他们的同事、以及中山医院消化外科和瑞金医院肝脏移植中心医生的大力支持和帮助，本所的邢枫医生为获得肝脏标本尽心尽力 参 考 文 献 [1]Mabuchi A, Mullaney I, Sheard P, et al. Role of hepatic stellate cells in the early phase of liver regeneration in Rat: formation of tight adhesion to parenchymal cells. Comp Hepatol, 2004, 3 Suppl 1: S29. [2]van de Bovenkamp M, Groothuis GM, Draaisma AL, et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity- induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci, 2005, 85: 632-638. [3]Oben JA, Roskams T, Yang S, et al. Hepatic fibrogenesis requires sympathetic neurotransmitters. Gut, 2004, 53: 438-445. [4]Xu L, Hui YA, Albanis E, et al. Human hepatic stellate cell lines,LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut, 2005, 54: 142-151. 《中华肝脏病杂志》版权 |