【关键词】 肝炎病毒，鸭； 肝炎病毒，乙型；肝康栓 Study of inhibitory effects of Gankang suppository on hepatitis B virus and its impact on serologic biochemistry in ducklings LI Hui, TIAN De-ying, XU Dong, WU Liang, NI Ming, MA Xiao-jun. 【Key words】 Hepatitis virus, duck; Hepatitis B virus; Gankang suppository 【First author抯 address】 Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China Corresponding author: TIAN De-ying, Email: dytian@tjh.tjmu.edu.cn 肝康栓在临床上治疗乙型病毒性肝炎已取得了较好效果。我们采用鸭乙型肝炎模型研究肝康栓在鸭体内抗鸭乙型肝炎病毒（DHBV）和改善血清生物化学的作用。 一、材料与方法 1. 动物：一日龄樱桃谷雏鸭（雏鸭）76只，体重45～50g，购自广西桂柳家禽公司华中孵化场。 2. 药物和制剂：肝康栓由本院和武汉同药药业有限公司共同研制；阿昔洛韦片（ACV）购自湖北科益药业有限公司。DHBV DNA强阳性（5×107拷贝/ml）血清采自上海麻鸭（由上海市公共卫生中心提供），-70℃保存。Real-time PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR引物由上海基康生物技术有限公司合成。 3. 主要仪器：罗氏Lightcycler实时荧光定量PCR仪购自上海罗氏诊断产品有限公司，Abbott（雅培）Aeroset全自动生物化学分析仪购自美国雅培制业有限公司诊断产品部。 4. 鸭乙型肝炎模型制备：引物设计：根据GenBank上检索的DHBV DNA序列，选择同源序列。遵从引物设计原则，设计并合成一对引物扩增DHBV DNA的1317～1772段基因。上游引物：5′-GCTGGCCTAATCGGATTACT-3′，下游引物：5′-AGACAGCGTGGCTAATTGAG-3′。模型制备和筛选：1d龄雏鸭64只，经腹腔注射DHBV DNA强阳性血清0.2ml。于感染后第8天腿静脉采血，分离血清，用PCR法筛选DHBV DNA感染阳性雏鸭。 5. 分组：76只雏鸭随机选取64只制备模型，12只作为正常对照组。 64只雏鸭经腹腔注射上海麻鸭DHBV DNA强阳性血清后，有52只成功感染，可作为实验动物模型。从这52只雏鸭中随机选取48只，并将其随机分成3组：治疗组、模型对照组和药物对照组，每组均为16只；治疗组给予肝康栓（含无环鸟苷800mg/kg、甘草甜素2000mg/kg、香菇菌多糖1000mg/kg）治疗，直肠给药；模型对照组给予等量等渗盐水灌胃；药物对照组以ACV按100mg/kg灌胃。均1次/d，连续给药28d。并分别于感染后第8天（为给药0d）、给药14d、给药28d和停药7d腿静脉取血（0.5ml/只），分离血清，-70℃保存待检。 6.检测指标与方法：（1）Real-time PCR法检测DHBV DNA：参照Bieche等[1]的标准曲线制备方法制备范围为5×103拷贝/ml～5×107拷贝/ml的外标准品，并绘制标准曲线。所用引物同上。检测血清中DHBV DNA水平按试剂盒说明书进行，计算DHBV DNA拷贝数。（2）检测血清ALT和AST：按试剂盒说明书进行。 7. 统计学分析：计量资料以x-±s表示，同组内自身前后比较用配对t检验，同期组间均数比较用多组q检验。 二、结果 1. 血清DHBV DNA水平：各组雏鸭不同时间血清DHBV DNA水平变化比较见表1。 2. ALT、AST水平：各组雏鸭不同时间血清ALT、AST水平变化比较见表2，表3。 三、讨论 DHBV已被国内外研究者广泛用于抗HBV的实验研究。DHBV模型的病毒血症持续时间较长且较稳定，可以用作抗HBV药物筛选的动物模型。ACV是一种抗病毒药物，对HBV有一定的抗病毒作用[2]，国内外很多学者都用ACV作为抗HBV药物筛选试验的对照药物[3，4]。 体外实验证实肝康栓能有效地抑制2.2.15细胞内HBV复制, 具有较显著的体外抗病毒活性。我们应用鸭乙型肝炎模型研究肝康栓在鸭体内抗病毒和改善血清生物化学指标的作用，客观地反映了肝康栓治疗及停药后机体内DHBV DNA、ALT、AST的变化情况。结果显示，肝康栓治疗组雏鸭的DHBV DNA水平在给药后14、28d及停药7d均较给药前降低，表明肝康栓能有效的抑制雏鸭体内DHBV的复制。与同期模型组比较，治疗组给药28d和停药7d时ALT水平降低，给药14d时AST水平降低，提示肝康栓具有改善血清生物化学指标的作用。 在肝康栓的组分中，甘草甜素为临床常用肝病药物，能有效地改善慢性肝炎患者的血清生物化学指标，能降低慢性肝炎患者发生肝硬化和肝癌的概率；香菇菌多糖为免疫增强剂, 无环鸟苷为抗病毒药, 两者对病毒性肝炎特别是乙型肝炎的疗效均已被国内外学者肯定。但两者口服吸收效果较差, 特别是无环鸟苷，口服后吸收缓慢且不完全, 口服生物利用度约为15%～30%, 需每日6次给药, 极不方便, 限制了其应用。而肝康栓是上述几种药物的复方制剂, 经直肠给药, 无肝脏的首过效应, 很好地克服了其缺点, 使各药协同发挥作用, 提高了生物利用度。 参 考 文 献 [1]Bieche I, Olivi M, Champeme MH, et al. Novel approach to quantitative polymerase chain reaction using real-time detection: application to the detection of gene amplification in breast cancer. Int J Cancer, 1998, 78: 661-666. [2]Cao HP, Tao PZ. Anti-hepatitis B virus effects of lamivudine and other five drugs in vitro. Zhonghua Yixue Zazhi, 2001, 81: 1004-1007. 曹鸿鹏,陶佩珍.拉米夫定等六种药物的体外抗乙型肝炎病毒作用.中华医学杂志，2001,81:1004-1007. [3]Hantz O, Perigaud C, Borel C, et al. The SATE pronucleotide approach applied to acyclovir: part II. Effects of bis (SATE)phosphotriester derivatives of acyclovir on duck hepatitis B virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Res, 1999, 40: 179-187. [4]Chen YX, Guo SH, Qi ZY, et al. Experimental study on the effect of combination therapy with lamivudine and famciclovir against duck hepatitis B virus in vivo. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2001, 9:209-211. 陈压西，郭树华，齐珍元，等.拉米夫定联合泛昔洛韦抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究.中华肝脏病杂志,2001,9:209-211. 《中华肝脏病杂志》版权 |