【摘要】 目的 应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建血小板衍生生长因子（PDGF）-BB刺激的大鼠HSC上调基因的cDNA消减文库，从分子生物学角度阐明PDGF在肝纤维化中的作用机制。方法 以PDGF-BB刺激的HSC作为实验组，以未用PDGF-BB刺激的HSC作为对照组，分别收获细胞提取总mRNA，并逆转录为cDNA。经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR扩增。将产物与pGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果 成功构建了PDGF-BB刺激HSC差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到93个200～1000bp的插入片段。挑取含有插入片段的31个克隆进行测序，通过生物信息学分析获得13种已知基因序列，主要包括电压依赖性阴离子通道、热休克蛋白质47、Ras家族基因RAN等蛋白质基因。结论 PDGF-BB作为最有效的促有丝分裂原在激活HSC过程中上调某些与细胞生长相关的蛋白质、参与细胞内代谢的蛋白质及分子伴侣蛋白质等基因的表达，这将为进一步阐明PDGF-BB刺激HSC介导肝纤维化的分子生物学机制提供理论依据。 【关键词】 肝星状细胞； 原癌基因蛋白质c-sis；抑制性消减杂交； 基因克隆 Screening up-regulated genes in hepatic stellate cells treated with PDGF-BB using suppression subtractive hybridization technique ZHU Li-ying*, CHENG Jun, MA Ying-ji, LI Yong-guo, ZHONG Li-hua, HONG Yuan. *Department of Infectious Diseases, Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China Corresponding author: CHENG Jun, Email: cj@genetherapy.com.cn, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China 【Abstract】 Objectives To construct a subtractive cDNAs library of up-regulated genes in rat hepatic stellate cells (HSCs) stimulated with platelet-derived growth factor (PDGF)-BB by suppression subtractive hybridization (SSH) technique, to clone the up-regulated genes associated with its regulation effects, and to elucidate the mechanism of the molecular biology of hepatic fibrosis involved in PDGF-BB. Methods The mRNA was isolated from HSCs stimulated with PDGF-BB and controlled with identical cells untreated with PDGF-BB, and then the cDNAs were synthesized. The cDNAs were designated as tester and driver. After being digested by restriction enzyme Rsa I, small-sized cDNAs were obtained. Tester cDNA was then divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2, individually. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent two times of nested PCR, the amplified cDNA fragments were subcloned into pGEM-Teasy vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E. coli strain DH5α. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blast search after PCR. Results The subtractive cDNAs library of up-regulated genes in HSCs stimulated with PDGF-BB was constructed successfully. The amplified library contained 102 positive clones. Colony PCR showed that 93 clones contained 200-1000 bp inserts. Sequence analysis was performed in 31 clones randomly, and the full length sequences were obtained with bioinformatics method and searched for homologous DNA sequence from GenBank; altogether 13 coding sequences were obtained, which were known ones. The genes mainly included voltage-dependent anion channel (VDAC), heat shock protein 47 and RAN-member RAS oncogene family genes. Conclusion Acting as one of the most effective mitogens, PDGF-BB up-regulated some gene expressions during stimulation of the HSCs, including some cell growth associated proteins, some proteins participating in intracellular metabolism and some molecular chaperone proteins. This work brings some new clues for studying the molecular biological mechanism involved in the up-regulated genes in PDGF-BB transactivated HSCs in hepatic fibrosis. 【Key words】 Hepatic stellate cell; Proto-oncogene proteins c-sis; Suppression subtractive hybridization; Gene cloning 近年来研究证实HSC是肝纤维化发生的细胞学基础，HSC的激活和增殖是各种病因导致肝纤维化形成的中心环节，活化的HSC合成ECM，其过度沉积则形成肝纤维化[1]。在HSC活化的诸多调控因子中，血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）是一种重要的细胞因子[2]。PDGF有三种二聚体形式（AA、AB、BB），其中PDGF-BB是最为有效的刺激HSC的生长因子和细胞内信号介质[3]。目前研究认为，最有前途的抗肝纤维化治疗是针对HSC的基因治疗，但存在的主要问题是有效基因甚少[4]，为了深入研究肝纤维化发生、发展的分子生物学机制，为肝纤维化治疗提供新的靶标，我们应用抑制性消减杂交（suppression sub-tractive hybridization, SSH）技术构建PDGF-BB作用于HSC后差异表达基因的cDNA消减文库，筛选并克隆PDGF-BB作用后HSC的上调基因。 材料与方法 1．材料：大鼠HSC及感受态E.coli DH5α为北京地坛医院传染病研究所保存；重组PDGF-BB购自英国Peprotech公司；Micro-FastTrack 2.0 mRNA抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司；PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒、50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒购自美国Clontech公司；Wizad SV Gel与PCR Clean-up System试剂盒购自美国Promega公司；T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体购自美国Promega公司。DNA 序列测定由北京三博远志生物技术有限公司完成。 2．药物处理及mRNA提取：用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液在25cm2培养皿中常规培养HSC，待细胞生长至对数期，计数细胞，按1×106/ml传代至2个25cm2培养皿中（分别为实验组和对照组）。培养24h后更换新鲜的完全培养液，并在实验组培养皿中加入PDGF-BB至终浓度为20ng/ml，对照组加入等量的PDGF-BB稀释液（DMEM），继续培养36h后收获细胞。用Micro-FastTrack 2.0 mRNA 抽提试剂盒分别提取实验组和对照组HSC的mRNA，经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计分别进行定性、定量分析。 3．消减杂交文库的建立：采用PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒，SSH方法按说明书进行：以实验组和对照组HSC的mRNA 为模板逆转录合成双链cDNA（dscDNA），并分别标记为Tester和Driver，dscDNA经RsaⅠ（一种4基列的）内切酶消化，产生相对较短的平端片段，纯化酶切产物。将Tester的dscDNA分为2份，分别连接寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2，然后与过量的Driver dscDNA进行杂交；合并两种杂交产物后再与Driver dscDNA进行第二次杂交，将杂交产物做首次抑制性PCR扩增（预变性温度94℃，退火温度66℃，延伸温度72℃，循环数为27），再用首次PCR产物进行第二次巢式PCR扩增（预变性温度94℃，退火温度68℃，延伸温度72℃，循环数为12），使Tester dscDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增。 4．消减文库扩增及克隆分析：扩增产物与pGEM-Teasy载体连接，转化DH5α感受态细菌，在含氨苄青霉素LB/X-gal/IPTG（isopropylthi-β-dgalatoside）培养板上，37℃培养12h。取白色菌落增菌，以pGEM-Teasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增，证明含有插入片段(200～1000bp)后，随机挑选其中31个克隆增菌，测序，并且应用生物信息学将测得序列提交GenBank数据库进行同源性分析。 结 果 1．mRNA的定性、定量分析：紫外分光光度计检测PDGF-BB刺激的及对照组HSC细胞mRNA数据见表1。琼脂糖凝胶电泳见mRNA为大于0.5kb清晰慧尾片状条带, 证实分离的mRNA完全满足进行消减杂交的要求。 表1 （略） 2．dscDNA 两端连接效率检测：以稀释的连接有Adaptor l和Adaptor 2的两组dscDNA为模板，分别用PCR引物1、GAPDH 3′和5′引物进行PCR扩增，将产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示两组dscDNA扩增产物浓度相当，说明dscDNA已与接头高效率连接，见图1。 3． cDNA消减文库消减效率的鉴定：分别以消减及未消减PCR产物为模板，用GAPDH引物进行PCR 扩增，分别在18、23、28、33次循环结束时从体系中吸取5μl进行电泳鉴定。结果显示:与未消减组PCR产物相比，消减组PCR产物中GAPDH 基因产物大大减少，说明所构建的消减文库具有很高的消减效率，见图2。 4．差异表达cDNA片段的扩增及克隆：杂交产物经两轮PCR扩增后，菌落PCR扩增结果显示为200～1000bp的插入片段，所获得的102个克隆中几乎都含有插入片段，这些条带可能代表差异表达的基因片段（图3）。 5．cDNA 测序与同源性分析结果：挑选31个克隆测序，与GenBank数据库进行初步比较，31个测序结果均与已知基因的部分序列高度同源（97%～100%），见表2。 表2 (略) 讨 论 肝实质细胞发生炎症损伤后，被激活的库普弗细胞及血小板释放PDGF，其与HSC上的PDGF受体结合，通过多种信号传导通路诱发细胞内一些生物学效应，促进HSC增殖活化、表达ECM。PDGF激活HSC的机制复杂，在此过程中存在多种细胞因子的正负反馈交叉调节，但对其确切作用及其调节机制知之不多。我们应用SSH技术筛选并克隆PDGF-BB刺激大鼠HSC后的上调基因，以进一步探讨PDGF激活HSC的分子生物学机制，为抗肝纤维化治疗提供新的线索。SSH是近年发展起来的一项新的基因克隆技术，具有实验周期短、易操作、可靠性强、假阳性率低等特点，能有效地分离扩增低丰度特异表达的基因[5]。应用SSH方法成功地构建了PDGF-BB刺激大鼠HSC上调基因的cDNA 消减文库，挑选出31个克隆进行测序分析，均与已知功能的基因高度同源（97%～100%），共编码13种已知功能的蛋白质。 在已知功能的基因序列中，主要包括以下几种类型：（1）细胞内结构与细胞生长相关蛋白质基因。如电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel,VDAC），是一种广泛分布于哺乳动物细胞线粒体外膜上的蛋白质，能够维持线粒体外膜的通透性，与各种代谢产物如三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸以及阴离子、阳离子的跨线粒体外膜转运有关[6]。VDAC 的主要功能之一是通过影响ATP、ADP在线粒体与细胞质间的转运而参与能量代谢过程[7]。VDAC的另一重要功能是参与细胞的凋亡过程，主要是通过动态生成一种叫做线粒体通透性转变孔道，该复合物开放则导致细胞凋亡，而关闭能防止细胞凋亡。HSC的凋亡作为一种潜在的调控机制，不仅能够减少已被激活的HSC数量，而且能够抑制HSC的激活，有利于肝纤维化的逆转和阻断。Fas/FasL及Bcl-2/Bax是两条可能的介导HSC凋亡的途径。定向诱导HSC的凋亡有可能成为抗纤维化的措施之一。（2）分子伴侣蛋白质基因。热休克蛋白质HSP47作为细胞内质网的一种分子伴侣，它的特异性作用底物是胶原，HSP47与Ⅰ～Ⅴ型胶原具有同等的亲合力。在内质网内与前胶原特异性结合，参与前胶原的折叠、装配、修饰、转运等过程，促进胶原的合成并维持内质网非折叠分子稳定性，有助于从内质网到高尔基体的分子正确组装和转运，HSP47与胶原的表达具有时间及空间上的一致性，这种一致性在培养细胞、胚胎组织发育和组织纤维化进程中均得到了证实[8]。组织器官纤维化的主要病理改变是ECM的异常合成和堆积，胶原蛋白是ECM的重要组成部分，HSP47作为胶原特异性分子伴侣，在肝、肾等脏器的纤维化形成过程中发挥着重要作用。（3）Ras家族基因。RAN是一种大量分布于细胞核内的GTP酶，是Ras类原癌基因大家族中的一员。RAN的功能多种多样，RAN及其结合蛋白质参与调控细胞周期中的多个过程，主要包括：通过调节核质物质转运而调控细胞周期调控因子的定位、核膜装配、调控DNA复制、调控纺锤体组装等[9, 10]。此外，RAN还参与细胞核结构的维持、mRNA转录和剪接以及RNA由核内向胞质中转运等[11]。（4）参与细胞内代谢的蛋白质基因。如DNA指导的RNA聚合酶和磷酸丙糖异构酶。前者是催化RNA合成的酶，即以DNA为模板，以4种核苷三磷酸（ATP、GTP、CTP和UTP）为底物，从5′到3′合成RNA的酶，任何基因的表达都必须通过RNA聚合酶的作用。后者是催化糖酵解的主要酶之一。（5）其他蛋白质基因。如间-α胰蛋白酶抑制物，具有抑制蛋白酶的作用。 通过对本研究中PDGF-BB上调大鼠HSC靶基因的分析，我们发现这些基因与体内能量代谢、HSC凋亡、胶原物质合成及细胞周期的调控等关系密切，在肝纤维化形成过程中发挥不同的作用机制。对于各种活性因子之间及其与HSC之间的具体作用机制，仍需进行更深入的研究。 参 考 文 献 [1]Herbst H, Wege T, Milani S, et al. 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