【摘要】 目的 构建人遗传印记基因PEG10的全长表达基因质粒，观察PEG10的过表达对人正常肝细胞及其非肝脏来源的对照细胞的作用。方法 将PEG10基因全长cDNA直接连入真核细胞表达质粒pcDNA3.1hisC中，以脂质体介导的方法将该表达质粒pcDNA3.1hisC-PEG10转染入人正常肝细胞及其对照细胞，采用RT-PCR、Western blot、MTT、TUNEL等方法分析PEG10基因在正常人肝细胞及其对照细胞中的表达和功能。 结果 限制性酶切及DNA测序结果均说明所构建质粒为PEG10全长表达质粒。该质粒经过稳定筛选后稳定表达于细胞内，促进人肝细胞的生长，抑制其凋亡，但对非肝脏来源的对照组细胞没有明显影响。结论 PEG10全长表达质粒的构建为进一步研究PEG10基因的效应和机制提供了有利的工具，研究结果显示PEG10基因可以促进人正常胚肝细胞增殖并抑制其凋亡，但对非肝脏来源的对照组细胞人胚肾细胞株293细胞没有明显效应。 【关键词】 转染； 质粒； PEG10 Construction of recombinant plasmid human imprinted gene PEG10 and the primary functional identification in transfected cell lines ZHANG Qiong, XIE Na, WANG Xiao-yan, CHANG Yin, LIN Yuan-yuan, LIN Ju-sheng. Department of Gastroenterology, Affiliated Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China Corresponding author: LIN Ju-sheng, Email: jushenglin@163.com 【Abstract】 Objectives To construct a plasmid expressing human imprinted gene PEG10 and to study the effect of overexpression of PEG10 in a stable transfected human normal liver cell line L02 and in non-liver derived cell line 293. Methods Full length cDNA of PEG10 open reading frame 1 was amplified and subcloned into a mammalian expression vector pcDNA3.1hisC. Recombinant plasmid was stably transfected into L02 cells and control cells via Lipofectamine 2000. The expression and the function of PEG10 in L02 cells and control group cells were examined using RT-PCR, Western blot, MTT and TUNEL. Results Recombinant plasmid was successfully constructed and confirmed through DNA sequencing and restriction digesting. PEG10 gene accelerated the growth of L02 cells and inhibited their apoptosis but it had no conspicuous effect on the non-liver derived cells. Conclusion The constructed expressing vector pcDNA3.1hisC-PEG10 provides a useful tool for further study on the effects and mechanisms of PEG10. Over-expression of PEG10 may promote L02 cells proliferation and inhibit their apoptosis, but not in the non-liver derived cell line 293. 【Key words】 Transfection; Plasmids; PEG10 肝癌有多种发生机制，有文献表明肝癌的发生与不同种基因包括癌基因，肿瘤抑制基因和DNA修复基因等均有密切关系。PEG10基因是一个反转座子衍生而来的父系表达的遗传印记基因，它定位于人七号染色体长臂2区1带[1]。有文献表明，PEG10基因高表达于肝癌细胞系HepG2和大多数肝细胞癌组织中，在其他消化道肿瘤细胞系如胰腺癌BxPc3、结肠癌Lovo等中则为弱表达，但在良性肝病组织及非肝脏来源的肿瘤细胞系如黑色素瘤、淋巴瘤等中没有检测出该基因的表达[1, 2]。提示PEG10基因可能在人肝细胞癌的发生过程中起到重要作用。为明确PEG10基因在细胞水平作用机制，我们根据 GenBank提供的PEG10序列（PubmedID：AB049834）构建了PEG10开放阅读框1CDS全长表达质粒，稳定转染人正常胚肝细胞L02和非肝脏来源的人胚肾细胞株293，鉴定其在转录水平和转录后水平在这两组细胞中的表达，并检测PEG10基因稳定转染前后对细胞增殖和凋亡的影响，为进一步探讨PEG10在细胞水平上的作用机制及基因治疗提供了有利的工具。 材料与方法 1. 材料：人正常胚肝细胞L02和人胚肾细胞株293购自中国典藏物培养中心。目的基因引物和内参照引物均由上海生工生物公司合成。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco BRL公司，T4 DNA连接酶、BamHⅠ及XbaⅠ限制性内切酶购自美国NEB公司，Taq酶及逆转录酶购自美国Promega公司。Lipofectamine2000和Opti-MEM购自美国Invitrogen公司，抗his单克隆抗体购自中国北京天为时代公司，质粒pcDNA3.1hisC由本实验室保存，质粒抽提纯化试剂盒和DNA凝胶回收纯化试剂盒购自美国AXYGEN公司。 2. PEG10表达质粒的构建：应用真核表达载体pcDNA3.1hisC，在pcDNA3.1hisC质粒中的1019bp和1073bp的位置分别具有BamHⅠ和XbaⅠ两个单位点的限制性内切酶位点，用两个限制性酶切位点将其切成具有粘性末端5.5kb的DNA大片段，从HepG2细胞株中用Trizol提取总RNA，逆转录成cDNA, 用含酶切位点的上下游引物以cDNA为模板进行PCR。正义链引物引入BamHⅠ酶切位点序列：5′-CGGGATCCAAGCACACCGGCCA TAA-3′，反义链含XbaⅠ酶切位点：5′-GGCTCT AGAGGCCCGGAAGATGAAT-3′，产物长度为1131bp。PCR条件为预变性94℃ 3min，95℃ 45s，59℃ 45s，72℃ 70s，30个循环，延长7min。用BamHⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶酶切目的基因PCR产物，使其具有这两个酶的粘性末端，利用胶回收试剂合进行酶切后产物的纯化。用T4 DNA连接酶将目的基因PCR产物和酶切后质粒连接成环状DNA。 3．质粒的转化、筛选及鉴定：无菌操作下，将处于对数生长期的大肠杆菌DH5α 50ml加入一只冰预冷的50ml离心管中，冰浴10min后4℃下4000r/min离心10min，弃上清液，将沉淀重悬于冰预冷的10ml 0.1mol/L的CaCl2(已过滤)，冰浴10min后4℃下4000r/min离心10min，弃上清液，用2ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2再次将沉淀重悬，此时大肠杆菌处于感受态。取100μl感受态加入5μl连接产物，冰浴30min，42℃热休克90s。再加入400μl无抗LB培养基，37℃震摇45min。取100μl菌液均匀涂于含有50μg/ml安苄霉素的LB平板，倒置平板，37℃过夜。次日可见平板上有菌落形成。无菌条件下挑取数个单菌落，用含50μg/ml安苄霉素的LB培养基进行扩增，利用质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒后，选用BamHⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶进行酶切鉴定证实正确后再进行DNA测序。 4．细胞的转染：将L02细胞和293细胞以每孔1×105个的数目接种于24孔板，待细胞丰度达到70%左右时按从低到高各孔分别给予的G418浓度为 200～1000μg/ml，每孔之间梯度差为100μg/ml。培养12d后L02细胞900μg/ml的孔内没有细胞存活，800μg/ml孔内有少量细胞存活，293细胞800μg/ml的孔内没有细胞存活，700μg/ml孔内有少量细胞存活,故将L02细胞筛选浓度定为800μg/ml，293细胞筛选浓度定为700μg/ml。转染前接种L02细胞和293细胞于100ml培养瓶中，待细胞达到85%丰度时各培养瓶均取15μl lipofectamine2000与7μg重组质粒分别加入200μl Opti-MEM液，混匀后室温避光孵育30min，再加入1.6ml的Opti-MEM液混匀，加入到培养瓶中，37℃ 5%的CO2孵育4h换用含10%血清的培养基培养。3d后分别加入含800、700μg/ml的G418的培养基，用有限稀释法培养单克隆转染细胞，并用含G418 200μg/ml的培养基维持培养。分别抽提细胞总RNA和细胞的总蛋白，以做PEG10的mRNA和蛋白表达检测。 5. 实验分组：L02细胞和293细胞生长与含10%胎牛血清的DMEM培养基中，各自分为空白对照组、转染空质粒组、转染重组质粒组。 6. PEG10基因转染细胞增殖曲线的测定（MTT法）将各组细胞以每孔8000个左右的数目接种到96孔板，待细胞贴壁后用无血清培养基同步化到G0期，再加入含10％胎牛血清的DMEM培养，并设空白对照。在24、36、48、60h和72h分别弃去培养基加入MTT（已过滤，5mg/ml）20μl，37℃孵育4h，弃去MTT，各孔加入150μl DMSO，室温下震荡10min，在570nm处，空白孔调零，测得各孔A值。 7. PEG10基因转染细胞凋亡分析（TUNEL法）：将各组细胞在直径为6cm的培养皿中培养，待丰度达到50%左右，弃去培养基，用甲醛＋丙酮液固定20min。按照TUNEL试剂盒说明书用碱磷酶法染色，凋亡小体被染成深蓝色。 8．统计学处理：MTT结果用SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析。 结 果 1．所构建质粒的限制性酶切分析与DNA测序鉴定结果：采用BamHⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶进行酶切，这两种酶在构建成功的质粒DNA中分别各有一个酶切位点，酶切产物分别为5.4kb和1.1kb。酶切后的片段与预计结果一致（图1）。测序在Invirogen上海公司进行，与GenBank核对完全一致，证实我们已将PEG10编码序列基因全长克隆入pcDNA3.1hisC质粒中。 2．质粒DNA在稳定筛选的L02细胞株及293细胞株中表达情况的鉴定：将稳定筛选出转染PEG10基因的细胞L02和293用Trizol提取总RNA，用RT-PCR法检测PEG10基因在该两株细胞中的mRNA的表达（图2），内参为β-actin，其正义链：5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，反义链：5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′，产物长度为613bp。用Perice试剂盒提取转染细胞胞浆蛋白，测定浓度后通过Western blot法用小鼠抗人的单克隆抗his标签抗体检测PEG10基因蛋白在转染细胞中蛋白量的表达情况（图3）。 3． PEG10基因转染细胞及其对照细胞生长曲线的检测：L02-PEG10细胞生长曲线在明显高于L02空质粒转染组及L02细胞组（P<0.05）, 而L02空质粒转染组与L02细胞组生长曲线差异无统计学意义（图4），而在293细胞组中，PEG10转染组及其对照细胞组生长曲线差异均无统计学意义。 4． PEG10基因转染细胞及其对照细胞凋亡情况的检测：通过TUNEL染色法，可明显看出PEG10稳定转染的L02细胞株没有发生凋亡，而L02细胞的空质粒转染组及阴性对照组均可见少量正常程序下凋亡的细胞（图5）。而对照组293细胞中PEG10转染组及未转染组均可见少量正常程序下凋亡的细胞，对照组间差异无统计学意义（图6）。 讨 论 PEG10基因，是一个新的父系表达的遗传印记基因，它定位于人类7号染色体长臂2号带1号位[1]。PEG10基因是反转座子衍生来的基因[1],其编码的蛋白与逆转录病毒gag-pol蛋白相似，不仅在许多孕期胎盘中高表达，而且在某些正常人器官包括心、肺中也有表达[3, 4]。PEG10与小鼠的myelin表达因子3有61.4%的同源性，而后者被认为具有转录因子的功能并在脑病的发展中调控myelin basic蛋白的表达。人肝癌组织及肝癌细胞系HepG2中可检测出该基因的高表达，而在其他组织例如良性肝病组织及淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞系未检测到PEG10基因的表达，且PEG10基因在肝癌组织中的表达比AFP的表达更具有特异性[1,2,5]。这提示PEG10基因的高选择性表达可能是将来治疗肝癌的一个新的分子靶。故我们根据PEG10全长，选择pcDNA3.1hisC作为载体，构建了表达PEG10编码序列全长的真核表达载体：pcDNA3.1hisC-PEG10。pcDNA3.1hisC是一个带有his标签的真核表达质粒，其特点是在没有针对该蛋白的抗体情况下可通过抗his抗体检测重组质粒在稳定筛选的真核细胞中mRNA和蛋白的表达情况。 脂质体是目前国内外真核细胞转染效率最高的方法之一，其技术路线是将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体和细胞膜的融合。通过有限稀释法，我们严格地将筛选出来的单克隆扩增培养后进行鉴定，保证了稳定筛选出来转染PEG10基因的细胞株的单克隆性。在成功转染PEG10基因的L02细胞株中，我们通过其生长曲线可以观察到L02细胞的增殖率明显高于其对照细胞；通过对其凋亡小体的检测（TUNEL法），可见在L02-PEG10转染细胞中未见到凋亡小体，而其对照细胞可在高倍镜下检测到凋亡小体。在同样稳定转染PEG10基因的293细胞株中其生长曲线和凋亡小体的检测与其对照细胞差异均无统计学意义。这一现象提示PEG10基因可能特异性的作用于肝脏来源的细胞株并促进肝实质细胞的增殖，抑制其凋亡，而对于非肝脏来源的细胞株则没有明显的影响。但PEG10通过何种途径引起这种现象的机制尚不清楚，需要进一步研究。 PEG10真核表达载体的构建和稳定转染PEG10基因的单克隆细胞株的成功筛选对探讨PEG10基因的对肝脏细胞的作用机制提供了有利的工具，为肝癌的基因治疗提供了一个新的有效的分子靶。 参 考 文 献 [1]Ono R, Kobayashi S, Wagatsuma H, et al. 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