【关键词】 尿酸； 树突细胞；肝炎病毒，乙型； T淋巴细胞，细胞毒性； 小鼠 Priming of HBV antigen-specific cytotoxic T cell response using uric acid treated dendritic cells in mice MA Xiao-jun, TIAN De-ying, ZHANG Zhen-gang, XU Dong, YANG Dao-feng, ZHU Hui-fen, LIANG Zhi-hui, Li Hui. 【Key words】 Uric acid; Dendritic cells; Hepatitis B virus; T-lymphocytes, cytotoxic; Mice 【First author抯 address】 Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430060, China Corresponding author: TIAN De-ying, Email: mxjzjl@163.com 近来研究提示，尿酸是免疫系统的一种重要的危险信号，它能刺激DC成熟，促进DC向T淋巴细胞呈递抗原[1]。尿酸可能成为一种有效的免疫佐剂。本研究以尿酸辅助负载HBV表位肽S28～39的树突状细胞免疫接种小鼠，对其产生的HBV抗原特异性CTL免疫效应进行了报道。 一、材料与方法 1. 实验动物和仪器：BALB/c健康小鼠（H-2d），SPF级，雌雄不限，6～8周龄，20～30g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。FACSCalibur流式细胞仪为美国Bectondickinson产品。CKX41倒置显微镜为日本Olympus产品。 2. 主要试剂：尿酸为美国Sigma公司产品，以5mg/ml浓度溶解于0.1mmol/L硼酸盐缓冲液（pH8.5～9.0）, 静置72h以上。脂多糖（LPS）、RPMI 1640培养基为美国Sigma公司产品。羧基荧光素乙酰乙酸购自美国Molecular Probes公司。胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。HBsAg特异性多肽S28～39 (IPQSLDSWWTSL，为H-2d BALB/c小鼠Ld限制S-HBsAgCTL表位)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，经过高效液相法及质谱法检测，纯度达到95%以上。以DMSO配成1mg/ml贮存，使用时以PBS稀释。小鼠重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，cat.315-03)和小鼠重组IL-4（cat. 214-14）为美国Peprotech公司产品。FITC-CD11c/IA/IE、PE-CD83/CD86单克隆抗体及同型对照抗体均为美国eBioscience产品。 3. DC的培养：参照文献[2]方法，略有改动。处死BALB/c小鼠，无菌取出胫骨和股骨，反复冲洗出骨髓细胞，用RPMI 1640完全培养基调细胞浓度为2×106/ml，接种入6孔培养板中，每孔1.5～2ml，37℃，体积分数5% CO2培养箱中培养。3h后去除未贴壁细胞，全量换液，每孔加入10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4。第3、5、7天半量换液，同时补足GM-CSF、IL-4。 4. 尿酸或脂多糖干预DC: 细胞培养第7天时，分别加入200μg/ml尿酸或1μg/ml 脂多糖培养。以加入等量RPMI 1640培养基的细胞作为对照,继续培养2d。 5. DC表面分子检测：收集培养第9天DC，以冰的流式缓冲液洗涤2次后，分别加入藻红蛋白（PE）或FITC标记的小鼠CD11c、CD83、组织相容性抗原Ⅱ分子（IA/IE）、CD86单抗及同型对照抗体，在4℃、避光条件下标记45min，洗涤，以流式细胞仪检测。以CellQuest软件分析结果。 6. DC体外负载S28～39多肽: 收集培养成熟的DC（选用脂多糖刺激成熟组），重悬，1×107/ml DC，加入10μg/ml S28～39多肽, 37℃、体积分数5% CO2条件下共培养6h。收集负载S28～39DC，PBS重悬后作为免疫接种用细胞。 7. 小鼠免疫接种: 小鼠分6组，即尿酸大、中、小剂量组、DC对照组、尿酸对照组和正常组，每组10只，按以下方法分别进行免疫接种。DC对照组，每只小鼠尾静脉注射1×106细胞（体积200μl）；大、中、小剂量尿酸组同时尾静脉注射不同剂量尿酸（分别为400、200、100μg）；尿酸对照组仅给予400μg尿酸免疫；给予等量PBS的小鼠作为正常对照组。1周后重复接种次，共2次。 8. 体内特异性CTL活性检测: 参照文献[3]方法，制备羧基荧光素双乙酸琥珀酰酯荧光标示剂（CFSE）荧光标记的同基因型脾细胞作为靶细胞，输入免疫小鼠体内，以流式细胞仪检测特异性CTL杀伤效应。第二次免疫后7d，无菌制备正常BALB/C小鼠（H-2d）脾细胞悬液（Tris-NH4Cl裂解红细胞），均分为两组。高浓度CFSE染色组（CFSEhigh）组与10μg/ml S28～39肽体外共培养4h，以终浓度5μmol/L CFSE染色标记；低浓度CFSE染色组(CFSElow）组不加肽共培养，以终浓度0.5μmol/L CFSE标记。收集2组标记细胞，PBS重悬后等量混合，每只小鼠尾静脉注射混合细胞2×107个（400μl 体积）。10h后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，以流式细胞仪检测CFSE染色阳性细胞，收集CFSE阳性细胞总数应在4×103个细胞以上。按以下公式计算特异性CTL细胞毒活性[3]，即：比率（R）＝ CFSElow百分比/CFSEhigh百分比；特异性杀伤率＝100%×[1-未(用抗原)免疫个体比率/已(使用抗原)免疫个体比率]。 9. 脾T淋巴细胞增殖反应的测定: 参照文献[4]，制备T淋巴细胞，CFSE标记后培养，以流式细胞仪检测其增殖反应。接种14d的小鼠，同前制备脾细胞悬液，以尼龙毛柱法分离T淋巴细胞。简言之，1×108脾淋巴细胞悬液通过尼龙毛柱，37℃，45min后洗涤尼龙毛柱，收集得到T淋巴细胞。以2.5μmol/L CFSE标记后调整细胞密度为1×106/ml。各组小鼠T细胞以每孔2×106/2ml接种入24孔板。分为S28～39多肽重刺激与PBS重刺激两大组，每孔分别加入10μg/ml S28～39多肽或等量PBS刺激。正常组小鼠脾T细胞加入刀豆素A(ConA)，加入10μg/ml S28～39或PBS刺激培养作为阳性对照组（ConA组）。设三复孔。37℃、体积分数5% CO2条件下共培养72h。流式细胞仪法检测细胞增殖，以Motif3.0软件分析增殖反应，得出各组增殖指数（PI）。 10. 统计学方法：计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS11.5软件进行统计分析，以Student-Newman-Keul检验和LSD多重比较分析或t检验分析数据。 二、结果 1. DC表面分子检测结果: 培养9d后，各组培养表面均高表达CD11c（各组间相互比较，P值均>0.05）。DC表面CD83, CD86, IA/IE的表达, 尿酸组或脂多糖组较RPMI 1640组明显增高（P值均<0.01）；尿酸组与脂多糖组比较, P＞0.05,差异无统计学意义,见表1。 表1 （略） 2. 小鼠脾T细胞的增殖反应：本实验对不同方法接种后小鼠脾T细胞对肽S28～39诱导的增殖反应进行了观察。各组免疫小鼠脾T细胞经PBS体外刺激后，与正常组相比均未见明显增殖，仅ConA组增殖明显（PI为2.287±0.146）。与PBS重刺激比较，正常组与尿酸对照组脾T细胞经S28～39重刺激后无明显增殖，PI无明显提高；其余各组免疫小鼠及ConA组脾T细胞均出现明显增殖（P值均<0.01）。S28～39重刺激后，DC 对照组脾T细胞观察到一定程度增殖（与正常组相比，P<0.01）；大、中、小剂量尿酸组脾脏T细胞则出现强烈的增殖反应（与DC对照组相比，P<0.05或P<0.01）。随着尿酸剂量的增加，其增殖能力逐渐增强。尿酸对照组脾脏T细胞未见明显增殖（与正常组相比，P>0.05），见表2。 3. 免疫小鼠特异性CTL细胞毒活性检测：免疫后1周与2周时，正常组R值为1.052±0.051，1.052±0.053；尿酸对照组R值分别为1.086±0.020，1.089±0.023。两组间不同时间R值相比较，t值分别为2.133，2.227，P值均<0.05，提示单独尿酸免疫后小鼠体内未能诱导出明显的CTL杀伤效应（小于4%）。免疫后2周与1周时相比，除正常组与尿酸对照组外，各组小鼠S28～39特异性CTL杀伤活性明显增高（P值均<0.01）。免疫后1周或2周时，各尿酸组小鼠特异性CTL杀伤活性明显高于DC对照组（P值均<0.01），并且随着尿酸剂量的增加，尿酸组CTL活性逐渐增高。2周时尿酸400μg组活性最高，为77.2%±3.0%。DC对照组亦有一定CTL杀伤效应（与尿酸对照组相比，P值均<0.01），见表3。 表3 （略） 三、讨论 研究表明，慢性HBV感染时，HBV可以直接感染血液中或骨髓中的DC前体，导致DC表型的改变，其功能和活性下降。DCs功能异常可导致T淋巴细胞刺激无能，不能有效诱导有效的抗病毒反应。CTL在控制和中止HBV感染中起着关键的作用，强烈的CTL免疫应答是病毒能否清除的关键[5]。所以，通过提高DC功能进而增强T淋巴细胞的免疫应答对治疗HBV感染具有重要的意义。 Shi等[1]发现尿酸可以显著增强疫苗诱导的gp120特异性CTL的细胞毒效应。Hu等[6]发现尿酸有助于机体排斥肿瘤的免疫反应，清除或抑制尿酸，易导致机体对肿瘤的免疫耐受。提示尿酸可能是一种有效的内源性免疫佐剂，能增强T淋巴细胞对外来抗原的免疫应答。本实验以尿酸为免疫佐剂，联合HBV特定表位肽S28～39负载DC进行免疫，有效地诱导抗原了特异性CTL效应的产生。随着尿酸浓度的提高和免疫次数增加，CTL效应逐渐增强，即CTL效应与尿酸呈量效依赖性。如尿酸剂量为400μg，接种2周时，CTL杀伤活性接近80%，产生了非常显著的杀伤活性。 有研究显示，单独以表位肽S28～39或荷肽的DC进行免疫，只能产生较弱的特异性CTL[2]。本实验尿酸、DC单独或联合等免疫方式产生的特异性CTL进行了比较。发现，单独尿酸免疫接种并不能促进特异性CTL效应产生；负载S28～39的DC单独免疫接种后，可以诱导出HBV特异性CTL效应，但活性较弱；两者联合免疫后，S28～39特异性CTL杀伤活性可显著提高。提示负载HBV肽的DC联合尿酸是最有效的免疫接种方式。 Shi等[1]观察到尿酸可增强DC表面的第二信号分子CD86、CD80的表达。本实验进一步证实，尿酸可使DC表面分子（CD83、CD86和IA/IE等）表达获得明显提高，而且尿酸的这种刺激活性与脂多糖类似。提示尿酸能够促进DC表型和功能的成熟。尿酸的这种免疫活性有利于DC刺激T细胞的活化增殖。Th细胞能够辅助CTL免疫效应的产生，尤其是Th1细胞活化增殖后分泌IFNγ、IL-2等细胞因子可促进CTL效应。联合尿酸和荷肽DC免疫后，小鼠脾脏T淋巴细胞对肽特异性增殖明显增强，其增殖程度与尿酸呈剂量依赖性。单独给予尿酸免疫接种并不能增强T细胞特异性增殖能力。尿酸联合DC免疫后，S28～39肽经由DC及MHC途径直接提呈，可能是Th细胞增殖增强的原因，此有利于诱导特异性CTL效应产生。 本研究表明，以尿酸作为佐剂，联合负载HBV表位肽的DC免疫接种，能诱导出较强的特异性CTL效应，机制可能与尿酸能够刺激DC成熟、活化，促进脾脏T细胞对抗原的特异性增殖等有关。 参 考 文 献 [1]Shi Y, Evans JE, Rock KL. Molecular identification of a danger signal that alerts the immune system to dying cells. Nature, 2003, 425: 516-521. [2]Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med, 1992,176: 1693-1702. [3]Coles RM, Mueller SN, Heath WR, et al. Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1. J Immunol, 2002, 168: 834-838. [4]Lyons AB. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J Immuno Meth, 2000, 243, 147-154. [5]Guidotti LG. Pathogenesis of viral hepatitis. J Bio Regul Homeost Agents, 2003, 17: 115-119. [6]Hu DE, Moore AM, Thomsen LL, et al. Uric acid promotes tumor immune rejection. Cancer Res. 2004,64:5059-5062 《中华肝脏病杂志》版权 |