【摘要】 目的 对比观察不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异性表达。 方法 Premier软件设计18对趋化因子受体引物，RT-PCR分析SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM6细胞侵袭转移潜能逐渐增强的人肝癌细胞株趋化因子受体谱。结果 4组不同转移潜能细胞株趋化因子受体表达谱存在明显差异（P<0.01），其中CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐降低。HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CCR12及XCR1比SMMC-7721表达明显降低甚至缺失 (P<0.01），而CXCR1（P＝0.006）、CXCR5（P＝0.003）表达高于低转移潜能组SMMC-7721。MHCC97-H和MHCC97-L比较，除CXCR2、CXCR6、XCR1外差异均有统计学意义，其中CCR1（P＝0.002）、CCR2（P＝0.004）、CCR5（P＝0.046）表达高于MHCC97-L。CXCR4在模板减量时只能在SMMC-7721组检测到。结论 高低转移潜能肝癌细胞株趋化因子受体表达在mRNA水平存在差异性表达，与肝癌细胞株差异性转移潜能相关。 【关键词】 癌，肝细胞； 受体，趋化因子；转移，肿瘤； 聚合酶链反应，逆转录 Different expressions of chemokine receptors in human hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potentials XUE Tong-chun, CHEN Rong-xin, YE Sheng-long, SUN Rei-xia, CHEN Jie, TANG Zhao-you. Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China Corresponding author: YE Sheng-long, Email: slye@shmu.edu.cn 【Abstract】 Objective To compare different expression profiles of all known chemokine receptors in human hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines with different metastasis potentials. Methods Eighteen pairs of chemokine receptor primers were designed using Premier software. Expression profiles of the 18 chemokine receptors on four HCC cell lines of lower to higher potentials of metastasis (SMMC-7721, MHCC97-L, MHCC97-H and HCCLM6) were analyzed by RT-PCR. Expression of CXCR4 was detected by RT-PCR. Results Expression profiles of chemokine receptors on four HCC cell lines with different metastatic potentials had significant differences (P < 0.01), in which CCR10, CXCR4 and CXCR6 expressions decreased gradually as the metastatic potential of the cell lines increased. The expressions of CCR3, CCR4, CCR10, CCR12 and XCR1 on HCCLM6 were significantly reduced compared with SMMC-7721 (P < 0.01), whereas the expressions of CXCR1 (P = 0.006) and CXCR5 (P = 0.003) exceeded that of SMMC-7721. Except for CXCR2, CXCR6 and XCR1, most of chemokine receptors on MHCC97-H were expressed differently compared with MHCC97-L (P < 0.05), in which expressions of CCR1 (P = 0.002), CCR2 (P = 0.004) and CCR5 (P = 0.046) exceeded MHCC97-L. CXCR4 was detected only on the positive controls and SMMC-7721 when the template of total RNA was reduced one-half in RT-PCR. Conclusion Chemokine receptors are expressed very differently at mRNA level on HCC cell lines with different metastatic potentials. The different profiles of chemokine receptors in tumor microenvironment and the function of CXCR4 in HCC should be further studied. Our findings have important implications in understanding the relationship between chemokine receptors and the metastatic potential of HCC. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Receptor, chemokine; Metastasis, neoplasm; RT-PCR 原发性肝癌为全球第三位致死性肿瘤，其复发和侵袭转移性很高。2001年Muller等[1]首次报道趋化因子受体[(chemokine (CXC motif) receptor), CXCR] 4和CCR7在乳腺癌转移患者肿瘤组织中高表达。在乳腺癌细胞中，CXCR4和CCR7通过信号途径介导肌动蛋白聚合和伪足形成，进一步诱导趋化和侵袭反应。目前，已有多个报道表明某些肿瘤细胞上趋化因子受体表达和肿瘤侵袭转移生物学特性密切相关[2，3]。但对原发性肝癌侵袭转移是否也与某些趋化因子受体有关尚未见报道。本研究旨在对比不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体基因表达并探讨其意义，为深入研究原发性肝癌器官特异性转移机制提供依据。 材料与方法 1. 细胞株及培养：人肝癌细胞株SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM6。SMMC-7721引自中国科学院上海细胞研究所，由本所传代和保存。该细胞株基本不发生转移。MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM6由本所建立并保存，其遗传背景相似，转移潜能逐渐增强。所有细胞以含10% FBS的高糖DMEM，5% CO2湿润条件下培养。 2. 主要仪器和试剂：细胞培养箱（Forma Scientific），低温高速离心机（Centrifuge 5804R, Eppendorf），凝胶成像摄像分析系统（ImageMaker VDS，Pharmacia Biotech），PCR仪（PCRExpress, 英国Hybaid公司），DMEM培养液，Trizol试剂（美国Invitrogen公司），MMLV逆转录酶及Taq酶（美国Promega公司）。 3. 引物设计：从GenBank中检索出人18种趋化因子受体及GAPDH mRNA序列号及相应序列, 采用Premier5.0引物设计软件设计引物，并用BLAST软件排除产物同源序列。 4. RT-PCR：（1）总mRNA按照Trizol说明书进行抽提和纯化。测A260和A280，计算浓度和纯度。甲醛变性凝胶电泳检测mRNA完整性。（2）RT-PCR采用两步法完成，cDNA第一链合成：PCR管中加入2μg总RNA, 1μg随机六聚引物，70℃加热5min，立即置冰上冷却、离心。然后管中依次加入：MMLV 5×反应缓冲液5μl，DNTP混合物10mmol/L 1.25μl，RNase抑制剂25U, MMLV RT 200U，加入DEPC水至终体积25μl，37℃ 60min，95℃ 5min，4℃ 2min。PCR: 按比例（灭菌双蒸水36.95μl，10×扩增缓冲液5μl，10mmol/L dNTP混合物1μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，25mmol/L MgCl2 3μl）制备Master Mix，均匀分配至各管，再加入相应50pmol/μl上下游引物各1μl及cDNA模板 2μl至终体积50μl。按下列循环条件扩增：94℃ 2min 1个循环；94℃ 30s，55℃ 35s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 7min 1个循环，4℃终止反应。20g/L琼脂糖凝胶，1×TBE 90V恒压电泳40min，凝胶成像系统扫描分析。 5. 统计学方法：统计学处理均采用SPSS12.0统计软件包进行，数据以均数±标准差表示，数据分析应用F检验, 同时绘制均数点图辅助判断趋势。P<0.05表示差异有统计学意义。 结 果 1. 趋化因子受体引物设计：根据Premier5.0引物设计软件，综合目的片段大小，引物3′端稳定性，二聚体，交叉引物，退火温度等因素综合设计18对趋化因子受体及内参照GAPDH引物对（表1）。BLAST分析表明，GenBank中未见与所设计产物同源序列。RT-PCR结果表明所设计的引物没有明显的二聚体及非特异条带形成。 2. SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM6细胞趋化因子受体RT-PCR结果见图1～3。高低转移潜能组均在同一反应体系中扩增目的基因和GAPDH，并以两者的吸光度比值来衡量各目的基因的相对量。统计学分析表明4组不同转移潜能细胞株趋化因子受体表达谱（18个）差异有统计学意义（P<0.01），均数点图表明CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐下降，但未见随转移潜能增加表达明显上调趋势的受体。进一步对比HCCLM6和SMMC-7721, 除CCR1、CCR9、CXCR3差异无统计学意义外，均有统计学意义，HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CCR12和XCR1与SMMC-7721相比明显低表达甚至缺失（P<0.01），而CXCR1、CXCR5表达高于低转移潜能组SMMC-7721，P值分别为0.006和0.003。高低转移组MHCC97-H和MHCC97-L比较时，除CXCR2、CXCR6、XCR1差异无统计学意义外，均有统计学意义，其中CCR1、CCR2、CCR5表达高于低转移潜能组MHCC97-L，P值分别为0.002、0.004、0.046。 3. CXCR4 RT-PCR结果：在总RNA模板量为2μg时，4组细胞株均可检测到CXCR4表达，且表达随转移潜能增强而减低。进一步实验表明，当RT-PCR所用总RNA模板减半到1μg时，只有阳性对照组PBL和低转移潜能组SMMC-7721检测到CXCR4的表达 (图4)。 讨 论 正常情况下，趋化因子受体多数表达在淋巴细胞表面，功能上主要参与炎症反应和淋巴细胞迁徙以及淋巴器官的形成。近年来文献报道其与多个恶性肿瘤的转移相关，并推测肿瘤发生转移可能和淋巴细胞的迁徙有相似或共同的机制[4]，最明显例子为CCR7/CCL21，其对淋巴细胞在淋巴道内定向迁移到输入淋巴管起关键作用，而多个淋巴道转移的肿瘤细胞亦高表达CCR7[5]。本实验中观察到4株细胞株之间趋化因子受体表达谱差异有统计学意义，其中CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐下降，高转移潜能细胞株HCCLM6和MHCC97-H表达明显高于低转移潜能细胞株的趋化因子受体也存在差异。所选4组人肝癌细胞株中，最低转移潜能细胞株SMMC-7721可检测到全部趋化因子受体，侵袭转移潜能最强的HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CXCR4、CX3CR以及XCR1比低转移潜能细胞株SMMC-7721低，甚至缺失。由于所做分析为体外的初步分析，肿瘤细胞在动物体内的侵袭转移是个多步骤多因素的过程，所以趋化因子表达谱在具体微环境尤其是选择性转移靶器官中可能会发生进一步功能性变化。已有报道显示肺提取物对MHCC-97H有明显的趋化作用[6]，所以体内肿瘤原发灶以及转移灶局部微环境可能会引起肝癌细胞株受体表达谱的功能性改变，值得进一步探讨。白冰等[7]对比分析了MHCC97-H和MHCC97-L代表4个趋化因子家族中的趋化因子，所检测的4个趋化因子均呈组成性表达，其表达水平可因癌细胞的转移潜能不同而异。结合趋化因子来研究趋化因子受体是一条途径，但它们之间的交叉结合增加了分析研究的困难。 CXCR4是HIV感染CD4+ T淋巴细胞的协同受体，是目前报道与肿瘤侵袭转移生物学行为相关最多的受体[2]，多数肿瘤转移灶可检测到CXCR4表达功能性上调, 并有报道表明缺氧诱导因子等因素通过CXCR4参与肿瘤侵袭和转移[8]。本研究中CXCR4在低转移潜能SMMC-7721中的体外表达高于HCCLM6，尤其是当模板量减半时CXCR4在HCCLM6上检测不到，但膜受体上表达是否与肿瘤细胞功能一致需要进一步验证。曾有报道在无转移潜能细胞株Chang Liver和低转移潜能细胞株HepG2均可检测到CXCR4表达，但HepG2上CXCR4对其趋化配体SDF-1α功能性无应答，在结合了SDF-1α后既无磷酸化也无内吞，表明其功能与表达水平不一致[9]。 本研究主要采用半定量RT-PCR方法，目前可用于检测基因表达水平的还有实时RT-PCR, 多重RT-PCR[10], 以及基因芯片方法。实时RT-PCR可对mRNA更准确定量，但费用昂贵。如果能够设计出合理的多重引物并优化好RT-PCR反应条件，多重RT-PCR的效率更高，其主要难度在于设计合理的引物。本研究设计18对趋化因子受体引物，产物主要在200～500bp之间，设计是综合考虑目的片段大小，引物3′端稳定性，二聚体，交叉引物，退火温度等因素。此外，基因芯片在检测范围和敏感性上有更大的灵活性和效率，但当目的基因为中度表达丰度时，RT-PCR和基因芯片的检测结果基本一致[11]。 原发性肝癌临床上多远处转移至肺，其侵袭和转移受到多个因素的影响[12]。探讨研究趋化因子受体与原发性肝癌转移的关系有利于对肝癌转移机制以及器官选择性的认识，为原发性肝癌的生物治疗和靶向基因治疗提供新的治疗方向。 参 考 文 献 [1]Muller A, Homey B, Soto H, et al. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature, 2001, 410: 50-56. [2]Rubie C, Oliveira-Frick V, Rau B, et al. Chemokine receptor CCR6 expression in colorectal liver metastasis. J Clin Oncol, 2006, 24: 5173-5174. [3]Ou DL, Chen CL, Lin SB, et al. Chemokine receptor expression profiles in nasopharyngeal carcinoma and their association with metastasis and radiotherapy. J Pathol, 2006, 210: 363-373. [4]Kakinuma T, Hwang ST. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol, 2006, 79: 639-651. [5]Gunther K, Leier J, Henning G, et al. Prediction of lymph node metastasis in colorectal carcinoma by expression of chemokine receptor CCR7. Int J Cancer, 2005, 116: 726-733. [6]Ji XN, Ye SL, Li Y, et al. Contributions of lung tissue extracts to invasion and migration of human hepatocellular carcinoma cells with various metastatic potentials. J Cancer Res Clin Oncol, 2003, 129: 556-564. [7]Bai B, Ou ZL, Hou YF, et al. Gene expression of chemokine in human hepatocellular carcioma cell line MHCC97 with different metastatic potential. Zhonghua Shiyanwaike Zazhi, 2004, 21: 925-927. 白冰,欧周罗,侯意枫,等.人肝癌细胞系MHCC97中趋化因子差异表达研究.中华实验外科杂志,2004,21:925-927. [8]Liu YL, Yu JM, Song XR, et al. Regulation of the chemokine receptor CXCR4 and metastasis by hypoxia-inducible factor in non small cell lung cancer cell lines. Cancer Biol Ther, 2006, 5: 1320-1326. [9]Mitra P, De A, Ethier MF, et al. Loss of chemokine SDF-1alpha-mediated CXCR4 signalling and receptor internalization in human hepatoma cell line HepG2. Cell Signal, 2001, 13: 311-319. [10]Kim S, Frye JG, Hu J, et al. Multiplex PCR-based method for identification of common clinical serotypes of Salmonella enterica subsp. enterica. J Clin Microbiol, 2006, 44: 3608-3615. [11]Etienne W, Meyer MH, Peppers J, et al. Comparison of mRNA gene expression by RT-PCR and DNA microarray. Biotechniques, 2004, 36: 618-620, 622, 624-626. [12]Ye QH, Qin LX, Forgues M, et al. Predicting hepatitis B virus-positive metastatic hepatocellular carcinomas using gene expression profiling and supervised machine learning. Nat Med, 2003, 9: 416-423. 《中华肝脏病杂志》版权 |