【摘要】 目的 探讨银杏叶提取物（EGb）对肝硬化大鼠肝窦微循环及门静脉高压的影响。 方法 25只雄性Wistar大鼠分为3组：正常对照组（5只），CCl4组（10只），EGb治疗组（10只）。肠系膜上静脉插管测定各组大鼠灌注EGb前后门静脉压力；肝组织匀浆中检测丙二醛（MDA）,血管内皮素（ET-1），血小板活化因子（PAF），一氧化氮（NO），构生型一氧化氮合成酶（cNOS）和诱生型一氧化氮合成酶（iNOS）水平；电镜观察各组肝窦微循环特征。结果 EGb灌注后CCl4组门静脉压由（8.7±0.8）mmHg降至（7.4±0.6）mmHg，降低幅度15%, t＝4.11，P＜0.01；EGb治疗组与CCl4组比较，门静脉压、肝组织MDA、ET-1、PAF、NO和iNOS水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01），肝窦内胶原沉积、微血栓形成、肝窦毛细血管化程度减轻。结论 银杏叶提取物能改善肝窦微循环障碍，降低门静脉压力，其可能机制是降低MDA、ET-1、PAF含量，下调iNOS的表达调节NO含量，对慢性肝病治疗具有重要意义。 【关键词】 肝硬化； 大鼠； 微循环；高血压，门静脉； 银杏叶提取物 The effect of Ginkgo biloba extract on portal hypertension and hepatic microcirculation in rats ZHANG Chun-qing, ZHU Yu-hua, WANG Jing, LIANG Bin, XU Hong-wei, QIN Cheng-yong. Department of Gastroenterology, Shandong Provincial Hospital, Shandong University, Jinan 250021, China Corresponding author: QIN Cheng-yong, Email: qinchengyong@163.com 【Abstract】 Objective To evaluate the effect of Ginkgo biloba extract (EGb) on hepatic microcirculation and portal hypertension in CCl4 treated rats. Methods Twenty-five male Wister rats were divided into a blank, a CCl4 treated and a CCl4 plus EGb treated group, and all were treated for 10 weeks. The free portal vein pressures were measured through catheterizations. Hepatic sinusoidal endothelial cells and other parameters of hepatic microcirculation were studied with transmission electron microscopy. The amounts of malondialdehyde (MDA), endothelin (ET-1), platelet-activating factor (PAF), nitric oxide (NO), cNOS and iNOS in the liver tissues were determined. Results The portal vein pressure of the CCl4 plus EGb treated group was (7.4±0.6) mm Hg while the pressure of the CCl4 treated group was (8.7±0.8) mm Hg. Aggregation of blood cells or microthrombosis in hepatic sinusoids, deposition of collagen in hepatic sinusoids and spaces of Disse, injury of endothelial cells and capillarization of hepatic sinusoid were significantly milder in the EGb group. The amounts of MDA, ET-1, PAF, NO and iNOS were markedly lower in the CCl4 plus EGb treated group than in the CCl4 treated group. Conclusion The results demonstrated that EGb can decrease the portal vein pressure and improve hepatic microcirculation in CCl4 treated rats. The mechanisms of this effect may involve its inhibition on ET-1, PAF, lipid peroxidation, and down regulation of the hepatic iNOS and NO expressions. 【Key words】 Liver cirrhosis; Rats; Microcirculation; Hypertension, portal; Ginkgo biloba extract 肝脏微循环障碍和门静脉高压是各种慢性肝病发生、发展的共同途径。我们既往研究表明银杏叶提取物（ginkgo biloba extract，EGb）能预防CCl4所致的肝损伤及细胞外基质沉积[1]，本研究通过进一步观察EGb对CCl4肝硬化大鼠肝脏肝窦形态及微循环及门静脉高压的影响，旨在探讨银杏叶提取物对慢性肝病的治疗价值。 材料与方法 1. 动物分组及处理：清洁级健康雄性Wistar大鼠25只，体重150～250g，山东大学动物试验中心提供。随机分为3组:（1）正常对照组（n＝5）:腹腔注射等渗盐水每100g 0.4ml，2次/周，持续10周；（2）CCl4组（n＝10）：腹腔注射CCl4，每100g体重0.4ml, 2次/周, 连续8周, 8周后改给予等渗盐水每100g体重0.5ml腹腔注射, 隔日1次, 连续2周；（3）EGb治疗组（n＝10）: 腹腔注射CCl4每100g体重0.4ml, 2次/周, 连续8周, 8周后改给予EGb-761（德国舒培药厂提供）腹腔注射，每100g体重4mg, 隔日1次, 连续2周。10周后实验结束。 2. 各组门静脉压力变化及EGb-761灌注对各组门静脉压的影响：各组大鼠禁食12h，腹腔注射苯巴比妥（50mg/kg）麻醉大鼠后，取右侧腹部切口，经肠系膜上静脉插管至门静脉主干连接四通道循环系统监测仪，以脊柱前缘为零点，测量门静脉内压力的变化。测定门静脉压,首先测定正常对照组、CCl4组和EGb治疗组的基础门静脉压力；同时抽取静脉血以备肝功能等检测。后经肠系膜上静脉缓慢灌注EGb（每100g体重4mg），滴速0.5ml/min，持续20min，间歇10min后再次测定各组灌注EGb后的门静脉压力。 3. 肝组织标本的采集：门静脉压力测定完毕后，处死大鼠取肝中叶组织, 光镜标本以4％甲醛固定，石蜡包埋；电镜标本以4%戊二醛固定；其余组织液氮冻存，备检肝组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）、血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、内皮素（endothelin，ET-1），NO、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）结构型（cNOS）和诱生型（iNOS）。 4. 肝组织学改变观察：肝组织标本行HE染色，光镜下观察各组肝细胞损伤及纤维化程度。正常对照组、EGb治疗组、CCl4组各取5例标本,制作电镜超薄切片, 每组随机选择100个肝窦，透视电镜观察各组肝窦Disse间隙有无血栓及胶原沉积、肝窦内皮有无损伤及程度、肝窦毛细血管化情况等, 并进行定量比较。 5. 肝组织匀浆检测：（1）肝组织匀浆的制备：从液氮罐中取出肝组织称重后移入玻璃匀浆器，按1∶5 (W/V) 加入组织匀浆缓冲液，在冰浴中充分匀浆。匀浆液在4℃以12000r/min离心20min，分离上清液，置于冰块上，在4h内测定指标。（2）MDA的检测：试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，按MDA试剂盒说明书所述方法用硫代巴比妥酸比色法测定肝组织中MDA含量。（3）ET-1水平检测：采用放射免疫法测定，试剂盒购自北京解放军总医院科技开发中心放射免疫研究所。（4）PAF水平检测：肝匀浆PAF的提取参照Whittle法，根据PAF标准品所致的血小板聚集程度的标准曲线计算出提取物PAF的含量。（5）NO含量测定：硝酸还原酶法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。（6）cNOS、iNOS活性测定：试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按照试剂盒说明操作。 6. 统计学分析：试验结果采用SPSS11.5统计软件进行方差齐性分析、t检验及卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 结 果 1. EGb-761对门静脉压的影响：EGb灌注前、后门静脉压：正常对照组分别为（5.2±0.3）mmHg和（4.9±0.3）mmHg；CCl4组分别为（8.7±0.8）mmHg和（7.4±0.6）mmHg，与正常对照组比，t＝9.3，P＜0.01，与灌注前比，t＝4.11，P＜0.01；EGb治疗组分别为（7.1±0.5）mmHg和（6.7±0.3）mmHg，与CCl4组比，t＝5.3，P＜0.01。提示EGb-761能明显降低CCl4大鼠门静脉压，对正常门静脉压无明显影响。 2. 各组肝功能变化：CCl4组ALT、AST及TBil水平均明显高于正常对照组，而Alb则低于正常对照组；EGb治疗组ALT、AST及TBil水平均明显低于CCl4组，而Alb则高于CCl4组，见表1（略），提示EGb-761能缓解CCl4所致的肝细胞损伤。 3. 光镜下肝组织学改变：正常对照组肝组织结构正常；CCl4组肝细胞显著肿胀，呈气球样变，可见点、片状嗜酸性小体，间质中有炎细胞浸润，并见大量纤维结缔组织形成；而EGb治疗组肝细胞肿胀减轻，偶见嗜酸性小体，纤维化程度明显减轻，见图1，2，提示EGb-761能抑制CCl4所致的肝组织损伤及肝纤维化。 4. 电镜下肝窦特征：电镜下每组各观察100个肝窦，正常对照组显示肝窦及Disse间隙通畅，无血栓形成及胶原沉积，内皮完整；CCl4组则表现为明显的肝窦微循环障碍：63个肝窦有红细胞聚集或微血栓形成，71个肝窦或Disse间隙胶原纤维沉积、管腔狭窄，46个肝窦内皮下有基底膜形成-肝窦毛细血管化，68个肝窦出现肝窦内皮损伤或破碎; 而EGb治疗组肝窦内皮损伤、细胞外基质沉积、肝窦内红细胞聚集或微血栓明显减轻，见表2，图3，4。 表2 （略） 5. 肝组织MDA，PAF、NO、ET-1水平：CCl4组MDA较对照组明显升高，EGb治疗组较CCl4组降低，说明EGb能减少CCl4所致的过氧化反应;与CCl4组比较, EGb治疗组ET-1和PAF均明显降低，见表3（略）。 6. 肝组织NO、cNOS和iNOS水平：CCl4组NO含量及iNOS活性高于正常对照组，cNOS活性亦见升高。EGb治疗组NO及iNOS活性显著低于CCl4组，cNOS活性亦降低，见表4。 表4 略 讨 论 肝窦是调节肝脏微循环及门静脉血流量的关键结构，肝窦腔通畅、内皮完整、肝窦的收缩和扩张共同影响着肝血流量的大小和门静脉压变化。肝窦和Disse胶原沉积、内皮细胞损伤、微血栓形成及星状细胞活化后收缩致窦腔狭窄是各种肝病引起肝脏微循环障碍和门静脉高压的共同特征。 本研究结果显示，正常大鼠肝窦腔宽大通畅，窦内皮极薄，不连续，有很多小孔，内皮下无基底膜。而CCl4组，有的肝窦因红细胞聚集或胶原纤维增生而使窦腔阻塞，有的肝窦出现肝窦内毛细血管化，有的肝窦内皮出现不同程度的损伤。这些微循环障碍的病理改变阻碍了肝细胞从Disse间隙摄取氧和营养物质，是加重肝细胞损伤和肝纤维化进展、造成肝内血流阻力增加及门静脉高压的病理基础。而EGb治疗组，肝窦内红细胞聚集、胶原纤维沉积、肝窦内皮细胞损伤、肝窦毛细血管化均显著低于模型组。结果提示，银杏叶提取物能防治慢性肝损伤大鼠肝窦内皮细胞损伤，减少肝窦及Disse间隙胶原沉积，抑制肝窦内微血栓形成，从而改善肝窦微循环障碍，保持肝窦形态的完整性。 肝硬化门静脉高压症的机制复杂,细胞外基质过度沉积致机械性阻塞为始动、不可逆因素；而血管活性物质分泌异常是门静脉高压的维持和促进因素，从血管活性物质入手探索药物治疗，是目前门静脉高压研究的热点之一。近年研究表明肝损伤后继发的细胞因子如ET、PAF、NO等血管活性介质在门静脉高压发生、发展过程中起重要作用。本研究发现，EGb治疗组门静脉压较CCl4组明显降低, 而且经肠系膜静脉灌注EGb后能使CCl4组门静脉压明显降低，说明EGb具有降低门静脉压的效应。 EGb改善肝脏微循环、降低门静脉压机制复杂，可能与以下因素有关：阻止肝组织ET的病理性增加。ET是目前已知的缩血管活性最强的多肽类物质[2］，Reichen等[3]报道血浆及肝组织ET-1水平升高与肝硬化及门静脉高压的形成有关。ET-1可直接作用于肝内微血管，使其收缩导致肝微循环障碍；可作用于肝窦内皮细胞，使其上的“筛孔”孔径变小减少肝窦血流；还可作用于贮脂细胞使Ca2+增多导致其收缩，从而使肝窦直径变小变窄，致肝血流减少。本实验观察到模型组ET含量明显增加，而给予EGb治疗后肝组织ET含量明显减轻，提示EGb治疗后ET含量降低，可能参与减轻肝脏血管收缩，改善肝脏血液灌注而降低门静脉压。 PAF是一活性较强的脂质介质，参与了各种肝损害及肝硬化的发生发展[4]。近年研究发现库普弗细胞可以通过旁分泌或自分泌产生PAF，是肝内PAF的主要来源。PAF受体在肝内主要局限于肝微脉管系统的肝门区系统及肝星状细胞内。库普弗细胞产生PAF后在肝内可引起微血管及肝星状细胞的收缩而增加门静脉血管阻力, 引起门静脉高压。而EGb是特异性PAF拮抗剂，可抑制PAF生物学活性的发挥，从而改善肝脏微循环。本组治疗后肝组织PAF含量明显降低,故可减少PAF所致的肝星状细胞及肝微血管的收缩而降低门静脉压。 NO和ET作为相互拮抗的一对血管活性物质，在肝脏微循环的调节中具有重要作用。NO在肝脏具有保护和损害双重效应[5]，应用药物抑制iNOS的合成，能改善实验大鼠的肝纤维化情况[6]。我们研究结果显示EGb治疗能显著抑制肝纤维化大鼠肝脏组织NO和iNOS活性，但对cNOS的活性则无明显影响，提示EGb 可能通过抑制iNOS活性从而降低NO的生成。 本研究结果显示CCl4模型组MDA含量明显升高，而EGb治疗组MDA含量明显下降，说明EGb具有抗脂质过氧化保护肝细胞的作用，抑制肝实质细胞的炎症反应，而炎症反映和细胞损伤又常常是微循环障碍的促进因素。初步研究表明银杏叶提取物能通过多环节改善肝窦微循环、降低门静脉压，对慢性肝病治疗具有重要意义，值得深入研究。 参 考 文 献 [1]Zhang CQ, Zhu JR, Shi HM, et al. 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