【关键词】 大鼠； 肝移植； 肝细胞； 嵌合肝
The repopulation of human L02 hepatocytes in tolerant rats treated with retrorsine LIN Hu, MAO Qing, WANG Yu-ming, JIANG Ye-gui, JIANG Li.
【Key words】 Rats; Liver transplantation; Hepatocyte; Chimeric liver
【First author’s address】 Research Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Corresponding author: MAO Qing,
建立稳定持久的人鼠嵌合肝动物模型，必须提高移植细胞的增殖能力[1]。倒千里光碱与部分肝切除术（Rts/PH）联合应用，是移植肝细胞增殖常用模式。我们对诱导免疫耐受的大鼠腹腔注射倒千里光碱，2周后行2/3肝切除术，同时经脾移植1，1’2双十八烷23，2，3’，3’2四甲基吲哚羧花２高氯酸盐（DiI，美国Sigma公司）染色后的L02细胞，建立Rts/PH肝细胞增殖模型；采用免疫荧光、DiI荧光示踪等方法，检测嵌合于具有正常免疫活性大鼠肝内人L02细胞的存活、增殖情况。
一、材料与方法
1. 材料：生育期SD大鼠6只，购自第三军医大学实验动物中心。选择孕龄15～17d、质量250～300g大鼠为实验对象。L02细胞属于人正常肝细胞，购自中国科学院上海细胞生物学研究所，加入胰酶酶解后重新混悬，血细胞计数板计算肝细胞的数量，台盼蓝拒染法计算存活率，超过80%的用于实验。
2.方法：诱导胎鼠免疫耐受：孕龄15～17d的SD大鼠乙醚麻醉，沿孕鼠腹白线逐层剪开，暴露子宫，将50μl人L02细胞悬液（含1×108个细胞）缓慢经孕鼠子宫壁注射到胎鼠腹腔，逐层缝合。至孕鼠自然生产。药物配制：具体方法见文献[2]。实验分组与药物注射：孕鼠随机分2组，产胎鼠各约30只：实验组胎鼠出生3周和5周腹腔内各注射倒千里光碱30mg/kg；对照组胎鼠出生3周和5周腹腔内各注射等量等渗盐水。出生7周，两组大鼠在乙醚麻醉后行2/3肝切除并经脾移植已标记DiI的L02肝细胞悬液100μl（浓度超过1012/L ）。2/3肝切除术：切开腹白线暴露肝脏，用细丝线分别结扎左前叶、右前叶、右后叶及尾叶后切除，保留肝中叶，腹腔青霉素抗炎。DiI荧光染色：具体方法见文献[3]，标记细胞经4g/L台盼蓝染色计数后，用PBS液调整细胞浓度为1.0×1012/L；于荧光显微镜（日本Olympus公司）诺丹明滤片下进行荧光观察并照相。L02细胞移植：出生7周实验组胎鼠腹白线逐层剪开，暴露脾，自脾系膜缘进针，向脾体和脾尾方向，将100μl经DiI染色的L02细胞悬液缓慢注入。标本收集：L02细胞移植后第1周取标本，第2周始每2周取1次，至第8周后按移植后4、6个月取标本。每次每组取4只大鼠。大鼠行肝部分切除术后，新鲜肝组织送冰冻切片。（1）DiI荧光示踪法：用DiI染色L02细胞后，移植前于荧光显微镜下观察；L02细胞移植后，取大鼠新鲜肝组织送冰冻切片，在荧光显微镜下观察。（2）免疫荧光检测肝组织人白蛋白：新鲜肝组织冰冻切片，厚4～8μm，室温放置30min；入4℃丙酮固定10min，37℃下100ml/L封闭血清孵育20min，滴加鼠抗人白蛋白单克隆抗体（美国Sigma公司，滴度1∶400）4℃过夜；加荧光标记第二抗体，FITC标记山羊抗大鼠IgG（北京中杉公司，滴度1∶100），37℃暗室下孵育45min。用900ml/L缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜（瑞士Zeiss公司）下观察。PBS替代第一抗体作阴性对照。
二、结果
1. DiI荧光示踪：DiI染色的阳性细胞在绿色滤光片下显示为红色荧光，细胞均匀着色不能区分胞核与胞质。实验组于移植后1周～6个月，观察到L02肝细胞在鼠肝内的动态分布。L02细胞自第1周起一直呈亮度不大的散在均匀分布，该状态维持4个月，至6个月荧光细胞数目开始减少，亮度有所减弱，显示为片状均匀分布。对照组早期时相可见L02细胞分布在受体鼠肝内的门静脉区域，聚集成团，以后扩散到肝实质区域，荧光细胞数目减少较快，亮度逐渐减弱，维持10周左右。相应时相荧光细胞数目较实验组明显稀少（图1）。
2. 免疫荧光法检测鼠肝组织中人白蛋白：阳性细胞的胞质在激光共聚焦显微镜下显示为绿色荧光，与周围大鼠肝细胞界限清楚，胞核未着色。实验组移植后2周～6个月大鼠均检测出人白蛋白；对照组移植后2～8周大鼠可检测出人白蛋白。两组均以4周发现绿色荧光细胞最多，实验组比相应时相对照组阳性细胞数目多。实验组肝实质显示了轻度到中度肝索结构的破坏、门静脉区炎性细胞浸润和分散的巨大核肝细胞，这些巨大肝细胞都有大的细胞核；对照组未明显见上述现象。实验组和对照组均未见肝纤维化、肝细胞坏死等（图2）。
三、讨论
先用人胎肝细胞诱导胎鼠对人肝细胞产生免疫耐受，再把人肝细胞移植到正常大鼠肝内，可建立针对移植物耐受的动物模型[4]。我们的人鼠嵌合肝模型建立在正常免疫系统基础上，嵌合于鼠肝细胞中的是正常人肝细胞，对多种肝炎致病因子易感，因此可利用人鼠嵌合肝模型进行已知和未知肝炎致病因子的研究。我们采用亲脂性碳花青荧光染料DiI标记整个细胞，荧光衰减非常慢。本实验DiI荧光及免疫组织化学均显示，移植的L02细胞首先到达远端门静脉区域和肝窦，以后逐渐扩散到肝实质区域，在倒千里光碱的作用下，散在分布的L02细胞开始成族增殖。实验组L02细胞一直呈亮度不大的散在均匀分布，提示移植细胞扩散到肝实质区域后很快分裂增殖，导致荧光细胞亮度减弱；而对照组相应时相荧光细胞亮度虽大，但数目较实验组明显稀少，提示其分裂增殖相对较少，说明倒千里光碱对移植细胞有明显的促增殖作用。实验组荧光细胞维持6个月以上，而对照组维持8周左右，证实DiI荧光染料衰减很慢，对照组荧光最后的消失不是因为衰减，而是移植细胞有限的增殖能力和细胞活性下降所致。
采用免疫荧光技术，从移植后2周～6个月嵌合肝大鼠肝组织中检测出人白蛋白；对照组于移植后2～8周检出。两组均证实人L02细胞在嵌合肝中的存在，并具有生物学功能，但实验组比对照组阳性持续时间明显延长，均未见肝纤维化、肝坏死现象，说明倒千里光碱不仅提高了L02细胞在大鼠肝组织中的增殖能力，而且其肝细胞毒性不影响移植细胞的生物学功能，为Rts促进移植肝细胞的增殖和临床应用提供了依据[5]。另外发现，实验组肝实质出现肝索结构的破坏、大量炎性细胞浸润和巨大核肝细胞，而对照组不明显，体现了移植肝细胞与受体细胞的整合过程，并逐渐发生移植细胞的增殖、替代。
移植细胞要大量增殖，必须满足两个条件：移植肝细胞有更强的生长优势；供体细胞的更新必须超过正常肝细胞更新水平，二者相辅相存[6]。部分肝切除术给予嵌合肝再生刺激，提高供体细胞的更新水平；倒千里光碱强烈而持续阻断宿主肝细胞增殖的细胞周期，而移植肝细胞增殖的细胞周期却不受影响，使移植肝细胞有更强的生长优势，其具体机制尚不清楚。
倒千里光碱是千里光属植物种中所含吡咯烷类生物碱，可促进移植肝细胞的选择性生长，半衰期很短，但作用可持续数周至数月。Rts主要阻断肝细胞周期S晚期和G2期，即阻断了随后的有丝分裂；也能阻断肝细胞进入S期，与DNA结合阻断其合成。Laconi等[7]发现在外源性生长刺激如PH缺乏下，仅给予Rts处理，其结果同Rts/PH联合相似，提示除了维持移植肝细胞选择性生长优势以外，Rts的作用可能还有其他机制存在。我们也研究了单独给予Rts，同样能提高L02细胞的增殖能力，延长其生存时间，只是增殖速度较慢。Gordon等[8]研究Rts所致不可逆损伤的巨大肝细胞清除机制，发现Rts除了阻断肝细胞的有丝分裂，导致S晚期和G2期细胞增加外，也可因凋亡前体蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-xl的相对水平高低和所处位置不同，诱导凋亡，导致细胞损伤。
通过应用药物倒千里光碱后，提高L02细胞在人鼠嵌合肝中的增殖能力，延长存活时间，可获得稳定持续性的动物模型，为进一步研究病毒感染致病机制、抗病毒治疗和开发强效疫苗开辟了道路。
参 考 文 献
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[3]Han MZ, Zou YN, Zhao XQ, et al. Using DiI as a tracer in mouse bone marrow cells transplantation via portal vein. Zhonghua Qiguan Yizhi Zazhi, 2003, 24: 251.
韩明子,邹亚男,赵宪琪,等.DiI荧光示踪剂在小鼠骨髓细胞肝内移植中的研究.中华器官移植杂志,2003,24:251.
[4]Wu GY, Konishi M, Walton CM, et al. A novel immunocompetent rat model of HCV infection and hepatitis. Gastroenterology, 2005, 128: 1416-1423.
[5]Koenig S, Stoesser C, Krause P, et al. Liver repopulation after hepatocellular transplantation: integration and interaction of transplanted hepatocytes in the host. Cell Transplant, 2005, 14: 31-40.
[6]Laconi E, Laconi S. Principles of hepatocyte repopulation. Semin Cell Dev Biol, 2002, 13: 433-438.
[7]Laconi S, Pillai S, Porcu PP, et al. Massive liver replacement by transplanted hepatocytes in the absence of exogenous growth stimuli in rats treated with retrorsine. Am J Pathol, 2001, 158: 771-777.
[8]Gordon GJ, Coleman WB, Grisham JW. Bax-mediated apoptosis in the livers of rats after partial hepatectomy in the retrorsine model of hepatocellular injury. Hepatology, 2000, 32: 312-320.
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