【关键词】 癌，肝细胞； 肝炎病毒，乙型； 共价闭合环状DNA
Detection of hepatitis B virus cccDNA in liver tissues of patients with hepatocellular carcinoma ZHANG Tao, HAN Tao, GAO Ying-tang, CHEN Hao, DU Zhi, WANG Yi-jun.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Hepatitis B virus; Covalently closed circular DNA
【First author’s address】 Institute of Hepatobiliary Diseases, Tianjin Third Central Hospital, Tianjin 300170, China
Corresponding author: HAN Tao,
HBV属嗜肝DNA病毒家族，其基因组是双链松弛环状DNA (rcDNA)，相对分子量为（1.6～2.0）×109，全长约为3.2kb。在HBV的生命周期中，共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV的原始复制模板，对HBV的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义[1]。清除HBV cccDNA是目前抗HBV药物研究的一个重要目标[2, 3]。我们对天津市第三中心医院收治的20例HBV感染的肝癌患者肝组织（包括癌组织及癌旁组织）中cccDNA的存在状况进行了检测分析。
一、材料与方法
1．主要试剂及仪器：Taq酶、dNTP、氯化镁溶液、超纯水和DNA分子量标准等购自大连宝生物公司。Tris饱和酚（pH8.0）、氯仿、异戊醇购自上海生工生物工程公司。Tris碱、EDTA、十二烷基硫酸钠、蛋白酶K购自美国Promega公司。Plasmid-SafeTM ATP依赖性DNA酶购自美国Epicentre公司。DNA分子量标准购自北京鼎国生物技术有限责任公司。HBV DNA PCR荧光定量诊断试剂盒购自上海复星实业有限公司。PCR扩增仪购自杭州大和热磁有限公司，全自动凝胶图像分析系统（GIS-2010）购自上海天能科技公司。
2．标本：40份肝组织为20例肝癌患者的癌与癌旁配对手术切除标本，均取自天津市第三中心医院2004年4月-11月住院患者，其中男14例，女6例；年龄最大72岁，最小37岁，平均年龄60.67岁。所有肝癌病例均切取了肿瘤原位组织、癌旁组织，诊断符合2001年肝癌诊断标准[4]；病理结果表明，癌组织为原发性肝细胞癌，癌旁组织为肝硬化或者正常肝组织，手术切缘处无癌细胞残留。所有肝癌患者HBsAg、抗HBe、抗HBc IgG阳性，HBeAg阴性，并且均未进行过抗病毒治疗。
3. 肝组织中HBV DNA及cccDNA含量的检测：（1）提取肝组织中总DNA：对每例肝癌患者均提取癌组织及癌旁组织的总DNA，采用常规蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提，产物溶解于100μl TE缓冲液中，取4μl经20g/L琼脂糖凝胶电泳，并测量总DNA的含量。（2）提取肝组织中HBV cccDNA：取1μg总DNA用Plasmid-SafeTM ATP依赖性DNA酶常规酶切[3]，于70℃水浴30min以灭活该酶。（3）引物设计：基于rcDNA的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不被扩增，而cccDNA由于有完整的双链可以被有选择性地扩增。正义引物LB21（nt1545～1575）：5′-GTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTC ATCTGCCGG-3′；反义引物LB10（nt2279～2310）：5′-CTCCGAAAGAGACCAAATACTCAAGGACAGTT-3′。另设计一对引物位于负链缺口上游，可同时扩增rcDNA和cccDNA：正义引物P29（nt246～266）：5′-GAGTCTAGA CTCGTGGTGGAC-3′；反义引物P125（nt805～824）：5′-CA(A/G)AGACAAAAGAAAATTGG-3′。（4）PCR检测肝组织中HBV DNA含量：取肝组织中总DNA提取液用引物P29/P125检测，反应总体积23μl，其中总DNA提取液2μl，PCR 反应液19μl，引物P29/P125各0.5μl，Taq酶(1U/μl) 1μl；循环参数：94℃ 2min，94℃ 1min、60℃ 45s、72℃ 45s，共35个循环。取PCR产物7μl，20g/L琼脂糖凝胶电泳，应用GIS-2010凝胶成像分析系统进行分析并读取灰度值。（5）PCR检测肝组织中cccDNA的含量：取肝组织中HBV cccDNA的提取液用引物LB21/LB10进行检测，反应总体积26μl，其中cccDNA提取液2μl，PCR反应液22μl，引物LB21/LB10各0.5μl，Taq酶（U/μl）1μl；循环参数：94℃ 2min，94℃ 1min、68℃ 2min，共45个循环。取PCR产物7μl，20g/L琼脂糖凝胶电泳，应用GIS-2010凝胶成像分析系统进行分析并读取灰度值。
4. 荧光定量PCR检测血清中HBV DNA含量：按照HBV DNA PCR荧光定量诊断试剂盒使用说明书进行。
5. 统计学分析：采用SPSS11.5软件进行秩和检验、Spearman等级相关分析。
二、结果
1. PCR反应扩增目的片段：经反复实验优化PCR反应体系及反应条件，减少非特异性扩增。肝组织中cccDNA扩增片段长度为765bp（图1），肝组织中HBV DNA扩增片段长度为578bp（图2）。
2. 肝癌患者肝组织中HBV DNA和cccDNA的关系：20例肝癌患者中，17例（85%）在癌组织中检出HBV DNA，其灰度中位数为0.231，17例（85%）在癌旁组织中检出HBV DNA，其灰度中位数为0.829；但二者比较差异无统计学意义（P＝0.701）。9例患者（45%）在癌组织中检出cccDNA， 其灰度中位数为0.100，13例患者（65%）在癌旁组织中检出cccDNA，其灰度中位数为0.214；但二者比较差异无统计学意义（P＝0.213）。肝组织中的cccDNA与HBV DNA呈正相关（r＝0.778，P＜0.01）。
3. 肝癌患者血清中HBV DNA与肝组织中HBV DNA和cccDNA的关系：患者血清中的HBV DNA与其癌组织、癌旁组织的HBV DNA均呈正相关（r＝0.789，P＜0.01；r＝0.589, P＜0.01），患者癌组织、癌旁组织的cccDNA与其血清中的HBV DNA也均呈正相关（r＝0.544，P＜0.01；r＝0.562，P＜0.01）。其中9例患者虽然血清HBV DNA检测为阴性，但有3例（33.3%）在其癌组织、有5例（55.5%）在其癌旁组织中仍检测到cccDNA。
三、讨论
cccDNA是HBV DNA的复制中间体，是病毒感染得以维持的根源。HBV感染的肝癌患者在进行化疗或手术切除肿瘤的情况下，仍会出现HBV的再度激活，造成患者肝功能的恶化[5]。因此，了解肝癌组织及癌旁组织HBV cccDNA的存在状态，对于HBV感染的肝癌患者的抗病毒治疗具有十分重要的意义。然而，目前有关这方面的研究甚少。
由于在HBV感染的肝组织中存在不同复制阶段的HBV DNA，如cccDNA、rcDNA、单链DNA (ssDNA)、整合型HBV DNA等，增加了检测cccDNA的技术难度。本研究应用Plasmid-SafeTMATP依赖性DNA酶在微碱性pH条件下可消化线性双链DNA、线性单链DNA和环状单链DNA为脱氧核苷酸，而对闭合环状双链DNA或超螺旋DNA没有活性的特性来提取cccDNA[3]；并设计跨越rcDNA两个缺口的引物，使rcDNA不被扩增，而cccDNA由于有完整的双链可以被选择性扩增，从而进一步提高了检测cccDNA的特异性。
香港Yuen等[6]检测92例发生HBsAg血清学清除的CHB患者，发现他们的肝组织学改善，但37%的患者体内仍存在低水平HBV DNA，并主要以cccDNA的形式存在。本研究中，所有肝癌患者HBsAg、抗HBe、抗HBc IgG阳性，HBeAg阴性，其中9例（45%）在癌组织、13例（65%）在癌旁组织中检出cccDNA，并且在部分血清HBV DNA阴性的患者中，仍可在其肝组织中检测到cccDNA。这些结果一方面说明cccDNA在HBV慢性感染的自然病程中，可能是持久存在的；另一方面提示我们通过检测肝组织中cccDNA，可以为临床指导抗HBV治疗提供重要依据。
有研究者提出cccDNA在肝脏中的分布是不均匀的[7]，本研究分别检测了20例肝癌患者的癌组织及癌旁组织中HBV DNA及cccDNA，结果显示HBV DNA在癌组织及癌旁组织中不同（灰度中位数分别为0.231和0.829），cccDNA也是如此（灰度中位数分别为0.100和0.214），这一结果支持上述观点，但统计学分析结果显示，差异无统计学意义。
由于本研究采用半定量PCR方法，且样本量尚少，今后有必要进一步扩大样本含量，并完善检测方法。
参 考 文 献
[1]Addison WR, Walters KA, Wong WW, et al. Half-life of the duck hepatitis B virus covalently closed circular DNA pool in vivo following inhibition of viral replication. J Virol, 2002, 76: 6356-6363.
[2]Kock J, Baumert TF, Delaney WE 4th, et al. Inhibitory effect of adefovir and lamivudine on the initiation of hepatitis B virus infection in primary tupaia hepatocytes. Hepatology, 2003, 38: 1410-1418.
[3]Werle-Lapostolle B, Bowden S, Locarnini S, et al. Persistence of cccDNA during the natural history of chronic hepatitis B and decline during adefovir dipivoxil therapy. Gastroenterology, 2004, 126:1750-1758.
[4]Society of Liver Cancer. Criteria of the clinical diagnosis and staging for primary hepatocellular carcinoma. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2001, 9: 324.
中国抗癌协会肝癌专业委员会.原发性肝癌的临床诊断与分期标准.中华肝脏病杂志,2001,9:324.
[5]Merican I, Guan R, Amarapuka D, et al. Chronic hepatitis B virus infection in Asian countries. J Gastroenterol Hepatol, 2000, 15: 1356-1361.
[6]Yuen MF, Wong DK, Sablon E, et al. HBsAg seroclearance in chronic hepatitis B in the Chinese: virological, histological, and clinical aspects. Hepatology, 2004, 39: 1694-1701.
[7]Zhang YY, Zhang BH, Theele D, et al. Single-cell analysis of covalently closed circular DNA copy numbers in a hepadnavirus-infected liver. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100: 12372-12377.
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