【关键词】 内毒素类； 肝功能衰竭； 环氧化酶2
A study on the role of cyclooxygenase-2 in lipopolysaccharide mediated fulminate hepatic failure SHI Bai-nian, LIU Jiang, HE Jian-fang, DAI Li-cheng, ZHOU Jian-fang, ZHAO Wei-feng, GAN Jian-he.
【Key words】 Endotoxins; Liver failure; Cyclooxygenase-2
【First author’s address】 Central Hospital of Huzhou, Zhejiang 313000, China
应用LPS联合D-氨基半乳糖（D-Gal）复制肝衰竭模型，探讨LPS与环氧化酶2（COX2）的时效关系，探讨COX2作为肝损伤治疗的一个靶的意义。
一、材料与方法
1. 动物：选用的雄性SPF级BLAB/C小鼠，体重约20g，由中国科学院上海医学实验动物中心提供，8～12周龄。实验室内室温20℃喂养2周后进行实验，实验前禁食12h，禁水4h。
2. 主要试剂：RPMI 1640完全培养液（美国Gibco公司）,原位灌注消化液：5% Collangenase（美国Sigma公司） Percoll梯度离心液（广州威佳科技有限公司），D-Gal（重庆医科大学生物工程研究室）, LPS E.coli O55:B5（美国Sigma公司），小鼠IL-10、ICAM-1、TNFα ELISA试剂盒（上海晶美生物科技工程公司），Trizol（美国Invitrogen公司）。引物由上海生工生物工程公司合成：β-actin：上游5′-GGCA TGGGTCAGAAGGATTCC-3′,下游：5′-ATGTCA CGCACGATTTCCCGC-3′，产物500bp；COX2：上游：5′-ACACTCTATCACTGGCACCC-3′,下游：5′- GAAGG GACACCCCTTCACAT-3′，产物580bp。
3. 方法：（1）肝衰竭模型：36只小鼠共分3组。正常组6只，肝衰竭组24只，预处理组6只。肝衰竭组腹腔注入D-Gal/LPS (D-Gal 900mg/kg, LPS 10μg/kg)，分别在2、4、6、8h杀鼠（每时点6只），心脏采血和分离库普弗细胞；预处理组在造肝衰竭模型前用选择性COX2抑制剂罗非昔布（美国默沙东制药公司）1mg•kg-1•d-1溶于等渗盐水灌胃，连续7d，按上述方法造模后8h杀鼠，心脏采血和分离库普弗细胞；正常组和肝衰竭组每日以同等体积的等渗盐水灌胃。正常组腹腔注射等渗盐水200μl。小鼠均正常饮食和饮水。（2）生化检测：ALT、AST用Olympus2700自动生化仪检测。（3）肝脏病理变化：肝组织标本用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，3μm厚连续切片并进行苏木精-伊红染色。（4）肝脏库普弗细胞分离、纯化、鉴定：原位灌注法获得肝非实质细胞悬液后，Percoll梯度液SPS液按梯度液与细胞悬液（2～3）∶1的比例铺层，2000r/min离心20min，获得富含库普弗细胞的肝非实质细胞。将细胞移入试管中，以培养液制成细胞悬液，加入24孔培养板孔内培养(5% CO2恒温箱内、37℃)，用不含小牛血清的RPMI 1640培养液，调整细胞浓度为1.5×106/ml，接种于培养孔中，孵育30～60min后取出，洗去非贴壁细胞，获得纯化的小鼠肝库普弗细胞，消化下贴壁的库普弗细胞，离心洗涤，最终获得的细胞团块悬浮在2ml RPMI 1640完全培养液中，计数获得的细胞量，以台盼蓝染色检测细胞活性。做免疫细胞化学染色并采用印度墨汁吞噬试验, 在荧光显微镜下对库普弗细胞进行鉴定。结果显示库普弗细胞纯度95.5%，台盼蓝染色,活性细胞占94.8%。（5）RT-PCR: 将库普弗细胞调整细胞密度为106/管,每管按步骤分别加入lml Trizol，0.2ml氯仿，0.5ml异丙醇，lml 75%乙醇，孵育，提取总RNA。然后取总RNA 3.0μg，分别加Oligo(dT)10 1μl，5×RT-PCR缓冲液4μl，Rasin 1μl，10mmol/L dNTPs 1μl，逆转录酶M-MLV（200U/μl）1μl，补充经DEPC处理的双蒸水至20μl，混匀后37℃ 60min。取逆转录产物5μl，加10×Taq酶缓冲液5μl，dNTPs 1μl，上下游引物各1μl，25mmol/L MgCl2 4μl，Taq酶0.3μl，加双蒸水补足至50μl。PCR反应的条件是：95℃变性5min，94℃ 30s, 56℃ 45s，72℃ 45s，循环30次，然后，72℃ 7min。取5μl PCR产物在15g/L琼脂糖凝胶进行电泳观察结果。（根据100bp的DNA标准品确定产物的大小）。用PDQuestTM（Bio-Rad Laboratories）分析PCR产物的灰度，半定量分析COX2 mRNA/β-actin灰度比值。（6）血浆IL-10、TNFα、ICAM-1的检测：各小鼠采EDTA抗凝血，离心，留血浆 -20℃保存备用。分别用ELISA试剂盒按说明书操作检测。
4. 统计学分析：数据处理用SPSS10.0软件。所有数据用x-±s表示，多样本均数比较用单因素方差分析，预处理组与肝衰竭组变量的比较用两两t检验。
二、结果
1. 肝衰竭模型建立的评估：在造模后2h发现部分肝窦充血，少量炎症细胞浸润，肝组织结构仍完整，4～6h有少量肝细胞凋亡，片状坏死、炎症细胞浸润，7～8h见大量肝细胞凋亡、片状坏死，肝窦严重充血和坏死，无肝小叶结构，肝细胞组织模糊，有凋亡小体及弥漫性炎细胞浸润。造模后ALT、AST明显升高，0、2、4、6、8h 5个时点（正常对照组相当于0h）比较差异有统计学意义。见表1。
2. 肝损伤情况：实验检测了促炎因子TNFα、ICAM-1和抗炎因子IL-10来评价肝损伤情况，发现TNFα、ICAM-1、IL-10在0、2、4、6、8h 5个时点比较的F值分别为82.7、113.1、141.7（P<0.01），说明不同时点有差异，并随时间逐步升高，肝损伤情况随诱导时间而加重。见表2。
3. COX2的表达变化：正常对照组COX2 mRNA不表达，而肝衰竭组COX2 mRNA/βactin灰度值随时间的延长而增加，0、2、4、6、8h 5个时点比较的F值为82.7，P<0.01，说明COX2的表达不同时点有差异，并随时间逐步升高，LPS与COX2存在时效关系。见表2和图1。
4. 预保护后各变量的变化：实验选用了选择性的COX2抑制剂来观察其对D-Gal/LPS诱导的肝衰竭肝损伤的干预意义。结果发现，预处理组的COX2 mRNA、TNFα、ICAM-1、ALT、AST较肝衰竭组均有降低，差异有统计学意义，IL-10也有下降，但差异无统计学意义。见表3和图2。
三、讨论
本实验观察到，正常对照组库普弗细胞不表达COX2 mRNA。在肝衰竭组，库普弗细胞COX2 mRNA和血浆TNFα、ICAM-1、IL-10水平较正常组升高，且随时间的延长而增强，表明COX2 mRNA与内毒素存在时效关系。LPS能引起NF-κB的活化，诱生大量的TNFα、IL-l、IL-6、前列腺素、氧自由基等细胞炎症因子的释放放大其毒性作用。而LPS、NF-κB、TNFα、IL-l均能诱导COX2的活化，后者又能导致大量的前列腺素和其他花生四烯酸代谢产物的生物合成，加速加重炎症反应的发生发展，这些细胞因子彼此之间形成一个独特的细胞因子和化学介质网络，通过协同作用导致肝细胞坏死。LPS刺激多种细胞合成AA代谢产物参与单核巨噬细胞系统介导的细胞毒作用，具体的细胞机制尚不清楚。
选择性COX2抑制剂应用后，在同一时点（8h），预处理组血浆TNFα、ICAM-1、ALT、AST水平较肝衰竭组有明显降低，说明选择性COX2抑制剂能缓解LPS诱导的炎症。可以从以下几个方面来解释：第一，作为前列腺素的合成限速酶COX2受到抑制后，从而大大减少了炎性介质的产生。第二，NF-κB可诱导活化COX2，产生多种细胞因子，释放的细胞因子又可反过来进一步活化NF-κB和COX2，由此形成一个正反馈，使炎症不断放大。COX2 受到抑制后，细胞因子之间的通路得以打断，反馈机制不能形成，有利炎症的修复。第三，实验观察到选择性COX2抑制剂应用后IL-10稍下降，但差异无统计学意义。而IL-10是具有抗炎效应的，有证据表明IL-10能抑制炎性介质的产生，减轻肝细胞变性坏死，保护肝细胞；也有文献认为IL-10能有效抑制NF-κB的活性。实验中作为促炎因子的TNFα、ICAM-1在干预后明显降低，而抗炎因子IL-10降低不明显，这样的结果对于LPS诱导的肝损伤有什么样的意义有待进一步探讨。第四，非甾体类抗炎药物是IκB的抑制物，后者的活化在NF-κB的活化中起重要作用。COX2参与了D-Gal/LPS诱导的肝衰竭模型肝损伤机制，LPS与COX2存在时效关系，选择性COX2抑制剂对于改善LPS诱导的肝衰竭模型肝损伤有一定的积极意义，COX2可以作为肝损伤干预治疗的一个靶。
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