【关键词】 骨髓； 造血干细胞； 肝细胞； 免疫磁珠分离系统
A study of liver cell transformation from bone marrow hematopoietic stem cells ZHU Wei, QIU De-kai, LAI Zhuo-sheng, WANG Ya-dong, ZHANG Ya-li.
【Key words】 Bone marrow; Hematopoietic stem cell; Hepatocyte; Magnetic activated cell sorting
【First author’s address】 Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
Corresponding author: QIU De-kai,
为进一步明确向肝细胞分化的细胞为骨髓中的那一亚群细胞，我们将纯化后的雄性小鼠造血干细胞移植到雌性受体小鼠的体内，然后在受体小鼠的肝脏内进行检测，以确定有无供体来源的肝细胞存在。
一、材料与方法
1. 实验动物、主要器材和试剂：健康清洁级雌雄性纯系BALB/C鼠，8～12周龄，均由第一军医大学动物实验中心提供。主要试剂及材料：磁性活化细胞分选（magnetic activated cell sorting, MACS）分离用MiniMACS缓冲液，Sca-1的MACS免疫磁珠分离试剂盒（美国Miltenyi公司），MiniMACS磁性分离器，MACS阳性选择柱（MS+/RS+），一次性滤器， PE-RAMSca-1单克隆抗体(美国Caltag实验室提供)，PE-RAMIgG2b单克隆抗体，Cy-RAMCD45 单克隆抗体（美国基因公司提供），小鼠Y染色体探针（FITC标记），FITC检测放大试剂盒均购自英国Cambio公司。
2．实验方法：（1）纯化前Sca-1细胞测定：抽取供体大鼠骨髓获得单个骨髓细胞后加入缓冲液洗细胞，200×g离心10min，去上清液。用800μl缓冲液重新悬浮108个细胞。另外取1×106个细胞，加入PE-Sca-1单克隆抗体5μl，Cy-CD45单克隆抗体7μl，混匀，室温下避光25min，1000r/min离心5min，弃上清液，PBS洗涤1次，加1%中性甲醛液0.5ml，FACS检测纯度。(2) MiniMASC纯化Sca-1细胞：将108个悬浮细胞加入200μl Sca-1 MultiSort MicroBeads，混匀于6～12℃中孵育20min，加入标记体积5～10倍的MACS缓冲液200×g离心10min，去上清液，用1000μl缓冲液重新悬浮细胞。500μl缓冲液洗柱，将1000μl细胞悬液加入柱中，用500μl缓冲液洗柱，重复3次。将柱移出磁场，1ml缓冲液洗柱，用泵加压，收集阳性洗液。然后换1根新柱，重复1次，收集阳性洗液。(3) 纯化后Sca-1细胞的检测：分别取两次纯化后的细胞1×105个加入PE-Sca-1单克隆抗体2μl，Cy-CD45单克隆抗体7μl室温下避光25min，PBS洗涤一次，加1%中性甲醛溶液0.5ml，FACS检测。（4）将纯化的干细胞用无血清的1640培养液重新悬浮细胞，调整细胞浓度为＞5.0×105/ml，通过尾静脉将干细胞移植入受体鼠，每只鼠移植的干细胞＞1.5×105。（5）移植后的受鼠在层流室培养。移植后第3天开始行白细胞计数，直至小鼠白细胞计数稳定在正常水平。（6）肝脏切片的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测：干细胞移植后的小鼠在2、4、6、8周分批处死后，取肝脏行常规固定制成蜡块，切片厚度大约为3～5μm，用涂布有APES液的载玻片捞片。在杂交前先切片脱蜡，空气干燥；在43℃亚硫酸氢钠中孵育15～30min，37℃的蛋白酶K中消化，洗涤，乙醇中梯度脱水，空气干燥；在78℃ 70%甲酰胺或2×SSC中变性8min，迅速冷乙醇中淬火3min，梯度脱水，空气干燥备杂交用。小鼠Y染色体探针（FITC标记）预热同前，然后在78℃变性5min，置37℃孵育。取15μl加入每张玻片，封片，在42℃孵育过夜。第2天洗涤和放大的过程同上。封片剂封片，4℃黑暗中保存，用Olympus BX60荧光显微镜观察（滤镜WB，激发波长490～600nm），用SONY数码相机记录结果。
二、结果
1. 纯化前骨髓中Sca-1细胞的平均百分比为6.1%±1.2%，纯化后为72.3%±2.86%，纯化后Sca-1细胞的比例显著高于纯化前，P＜0.01；纯化前细胞活力平均为99.11%，纯化后平均为98.89%，前后差异无统计学意义，P＞0.05。
2. 干细胞移植后小鼠的长期存活率＞80%，移植后1周开始恢复正常活泼状态，饮食正常，皮毛顺滑，外周血细胞计数在7d时为7×108/L，10d后上升为1.2×109/L；体重在1周后也开始逐步上升，每天增加1g。病理显示，肝脏内细胞界限模糊，细胞水样变性，但体积大小正常，无萎缩表现和大量肝细胞坏死，炎症细胞浸润等，结构正常（图1，2）。
3. 干细胞移植后的Y染色体检测:干细胞移植后Y染色体出现率由移植前的0转变为移植后的100%，说明干细胞移植所需干细胞的数量比全骨髓移植所需细胞数量少即可以完全在受体小鼠的骨髓内存活并且替代供鼠的造血功能（图2）。
4. FISH检测的结果：干细胞移植后在肝脏切片中可以清楚地显示出Y染色体阳性的肝细胞（图3）。肝细胞核因为PE复染而呈现出红色，胞质为自发性黄绿色荧光，在红色的细胞核中有绿色的点状荧光（图3），显示该肝细胞Y染色体阳性，表明该肝细胞是由雄性供体小鼠的骨髓细胞转化而来。阳性的肝细胞全部在移植后6周处死的小鼠肝脏中出现，而且生存时间长的小鼠肝脏中更加容易找到阳性肝细胞。从结果中可以看出，Y染色体阳性肝细胞的形态特征与周围的肝细胞完全一样，在肝实质中呈散在分布的单个细胞，没有成簇、成片或者特定部位分布的特性。
三、讨论
骨髓细胞中细胞成分很多，具体可以转化为肝细胞的骨髓中何种亚细胞群尚待我们进一步探讨。Theise等[1]在小鼠骨髓移植实验中采用流式细胞仪分离出CD34+lin-的骨髓细胞单独进行异性移植，移植后肝脏中也出现了Y染色体阳性的肝细胞，说明至少可以转化为肝细胞的骨髓细胞中有CD34+细胞。那么到底是造血干细胞、间质干细胞，还是两者都有参与尚待进一步探讨。
造血干细胞是骨髓中最重要的成分细胞，其中最常使用的小鼠多能造血干细胞表面标志物是Sca-1（Ly6A）[2]，本实验发现经过两次过柱分离，骨髓造血干细胞的纯度可以由分离前的6.1%上升到了分离后的72.3%以上，而且细胞活力均不受影响，为下一步的移植提供了很好的移植物，造血干细胞成为移植细胞中绝对的主要成分。
造血干细胞移植后，小鼠迅速恢复了造血功能，一周以后外周血细胞计数开始逐步增加，10d后外周白细胞计数基本恢复正常。移植后的雌性受体小鼠核型分析显示为（40，XY），不仅表示雌性受体的骨髓在本实验中完全毁损，而且雄性供体的骨髓完全定植存活并且在雌性小鼠的体内发挥了造血功能。在组织切片上进行原位荧光杂交实验，结果显示在干细胞移植后的小鼠肝脏切片中存在有Y染色体阳性的肝细胞，说明该肝细胞来源于骨髓细胞。在切片上进行原位荧光杂交实验有一个最大的好处，就是可以更加清楚明确地判断出阳性细胞的位置和性质，进一步证实阳性细胞是肝细胞。因此我们改进了操作步骤，优化了实验条件，可以很清楚地在切片中观察到结果。切片中的肝细胞核均呈现出大而圆的红色荧光，胞浆仍然为自发的黄绿色荧光，而探针的绿色荧光很清楚地分布在肝细胞核中，而不是在细胞间隔中或其他种类的细胞中。可以确定骨髓来源的干细胞可以分化为肝脏的实质细胞。我们在进行了单纯干细胞移植后6周的肝脏中发现Y染色体阳性的肝细胞，并且存活时间越长，阳性细胞的数量越多。通过切片我们看不出Y染色体阳性肝细胞的分布有什么特点，它们随意散布在肝实质中，没有呈现规律性分布或成团、成簇的分布，这似乎再一次证明了我们的猜测，骨髓来源的肝细胞是通过血液循环将骨髓干细胞带入肝脏，通过窦状隙的循环直接进入肝索中[3]分化为细胞因子19阳性的小胆管细胞样细胞，然后在肝脏受到损伤时再分化为成熟的肝细胞。同时，我们发现Y染色体阳性的肝细胞出现的时间早于全骨髓移植者，因为在干细胞移植后6周的小鼠肝脏中即发现有Y染色体阳性的肝细胞，而全骨髓移植的小鼠最早是在移植后2个月的小鼠肝脏中出现。
参 考 文 献
[1]Theise ND, Badve S, Saxena R, et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation. Hepatology, 2000, 31: 235-240.
[2]Patterson JM, Johnson MH, Zimonjic DB, et al. Characterization of Ly-6M, a novel member of the Ly-6 family of hematopoietic proteins. Blood, 2000, 95: 3125-3132.
[3]Gupta S, Bhargava KK, Novikoff PM. Mechanisms of cell engraftment during liver repopulation with hepatocyte transplantation. Semin Liver Dis, 1999, 19: 15-26.
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