【摘要】 目的 研究枸杞多糖（LBP）预防大鼠酒精性脂肪肝（AFL）的效果，探讨其作用机制。 方法 125只Wister大鼠随机分为4组，正常对照组:用蒸馏水灌胃；5% LBP预防组和10% LBP预防组：LBP与乙醇同时灌胃，酒精组:单纯乙醇灌胃。比较4组大鼠：肝脏病理形态，血清ALT、AST、GGT，肝匀浆脂质过氧化酶［谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）］以及过氧化氢(H2O2)，肝细胞色素P4502E1（CYP2E1）基因及蛋白表达。 结果 10周时测定AST，5%和10% LBP预防组分别为（132.3±25.7）U/L和（127.5±29.1）U/L，GGT分别为（1.9±0.5）U/L和（1.8±0.7）U/L，酒精组AST为（245.7±32.1）U/L、GGT为（4.4±0.6）U/L，预防组与酒精组比较，差异有统计学意义，P<0.01，ALT预防组与酒精组比较，差异无统计学意义。10周时测定GSH-PX活性，5%和10% LBP预防组分别为（13.5±1.4）U•mg-1•min-1和（13.6±1.5）U•mg-1•min-1，SOD活性分别为（206.7±13.2）U/L和（203.2±18.8）U/L，酒精组GSH-PX活性为（7.2±1.6）U•mg-1•min-1和SOD活性为（116.5±13.6）U/L，预防组与酒精组比较，明显提高，差异有统计学意义，P<0.01。GSH含量，两预防组分别为（65.1±11.0）mg/g和（66.6±11.1）mg/g，酒精组为（30.5±10.7）mg/g，预防组与酒精组比较，明显增加，差异有统计学意义，P<0.01。MDA含量，两预防组分别为（5.1±0.3）nmol/mg和（5.1±0.4）nmol/mg，酒精组为（14.5±3.2）nmol/mg。H2O2两预防组分别为（135.4±23.5）mmol/g和（132.6±31.8）mmol/g，酒精组为（328.5±45.6）mmol/g，两预防组比酒精组明显减少，差异有统计学意义，P<0.01。CYP2E1基因表达，5周和10周两预防组分别为0.39±0.04, 0.40±0.06和0.41±0.05，0.42±0.08，酒精组分别为0.74±0.05和1.02±0.08。蛋白表达水平两预防组分别为3.49±0.36, 3.29±0.30和3.58±0.30，3.36±0.37，酒精组分别为5.63±0.44和7.90±0.26，两预防组比酒精组显著降低，差异有统计学意义，P<0.01。两预防组大鼠肝脏脂肪性病理变化明显轻于酒精组。 结论 LBP通过抑制CYP2E1基因及蛋白表达，减轻脂质过氧化反应，有效的预防AFL。
【关键词】 脂肪肝，酒精性； 预防和控制； 脂质过氧化作用； 细胞色素P450； 枸杞多糖
A study on the preventive effect of Lycium barbarum polysaccharide on the development of alcoholic fatty liver in rats and its possible mechanisms GU Sai, WANG Pi-long, JIANG Rong. Department of Gastroenterology, First Affilated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China
【Abstract】 Objectives To study the preventive effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on the development of alcoholic fatty liver (AFL) in rats and its possible mechanisms. Methods One hundred twenty-five Wister rats were randomly divided into 4 groups: a blank control group, with distilled water intragastric infusion (GI); an alcohol group, with alcohol GI; a 5% LBP plus alcohol GI group; and a 10% LBP plus alcohol GI group. Liver pathologic changes were studied together with the activity of serum ALT, AST, GGT, the activity of liver SOD, GSH-PX and the content of liver MDA, GSH, H2O2; CYP2E1 gene and protein expressions were also detected. Results At the end of ten weeks, the activity of serum AST [(132.3±25.7) U/L, (127.5±29.1) U/L] and GGT [(1.9±0.5) U/L, (1.8±0.7) U/L] of the two LBP groups were all significantly lower than those of the alcohol group [serum AST (245.7±32.1) and GGT (4.4±0.6) ] (P < 0.01). At the end of ten weeks, the content of liver MDA [(5.1±0.3) nmol/mg, (5.1±0.4) nmol/mg] and H2O2 [(135.4±23.5) mmol/g, (132.6±31.8) mmol/g] of the two LBP groups were significantly lower than those of the alcohol group [MDA (14.5±3.2) nmol/mgprot) and H2O2 (328.5±45.6)] (P < 0.01). The activity of SOD [(206.7±13.2) U/L, (203.2±18.8) U/L], GSH-PX [(13.5±1.4) U . mg-1 . min-1, (13.6±1.5) U . mg-1 . min-1] and the content of GSH [(65.1±11.0) mg/g, (66.6±11.1) mg/g] of the two LBP groups were all significantly higher than those of the alcohol group [SOD (116.5±13.6) U . mg-1 . min-1, GSH-PX (7.2±1.6) U . mg-1 . min-1 and the content of GSH (30.5±10.7) mg/g] (P < 0.01). At the end of five weeks, levels of CYP2E1 gene and protein expression of the two LBP groups were 0.39±0.04, 0.40±0.06 and 3.49±0.36, 3.29±0.30 respectively. At the end of ten weeks, levels of CYP2E1 gene and protein expression of the two LBP groups were 0.41±0.05, 0.42±0.08 and 3.58±0.30, 3.36±0.37 respectively. They were all significantly lower than those of the alcohol group [the gene expression (5 week: 0.74±0.05, 10 week: 1.02±0.08) and the protein expression (5 week: 5.63±0.44, 10 week: 7.90±0.26)] (P < 0.01). There were no typical alcoholic fatty liver pathologic changes observed in the two LBP groups. Conclusion LBP can effectively prevent AFL. This may be due to its effects in inhibiting the hepatocyte CYP2E1 expression and prevention of lipid peroxidation.
【Key words】 Fatty liver, alcoholic; Prevention and control; Lipid peroxidation; Cytochrome P450; Lycium barbarum polysaccharide
枸杞多糖（lycium barbarum pclysaccharide,LBP）是宁夏枸杞的重要抗氧化成分[1]，而自由基及其启动的脂质过氧化连锁反应是酒精造成肝细胞损伤的主要机制之一[2]。本实验通过LBP与乙醇同时灌胃方法，观察LBP预防效果，探讨其机制，为预防酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver, AFL）的发生、发展提供一种新的尝试。
材料与方法
1. 材料：清洁级雄性Wistar大鼠125只，7周龄，质量180～220g，购于第三军医大学实验动物中心。无水乙醇，为国产分析纯品，LBP由宁夏中药厂馈赠，配成5%、10%水溶液待用。ALT、AST试剂盒购于上海科华生物工程有限公司，GGT试剂盒购于日本第一化学株式会社，GSH-PX、SOD、MDA、GSH、H2O2试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
2. 方法：将125只清洁级大鼠随机分为4组，正常对照组30只，酒精组35只，5% LBP组、10% LBP预防组各30只，分笼饲养，每笼5只，全价颗粒饲料喂养（脂肪含量<5%）。参照文献[3]并稍加改进，酒精组给予40%（V/V）乙醇8g•kg-1•d-1（即21.05ml•kg-1•d-1），分2次灌胃，间隔时间9～10h，至5周末处死15只取标本，自6周始乙醇浓度增至50%（V/V）9g•kg-1•d-1（即19.35ml•kg-1•d-1），方法同前，至10周末，大鼠死亡6只,处死余下的14只。药物预防组在乙醇灌胃（方法同上）的同时加用药物（5% LBP、10% LBP组）同时按大鼠每100g 0.5ml灌胃,至5周和10周，LBP的剂量选择参照文献[4]，正常对照组用等体积的蒸馏水分2次灌胃。各组在处理5周和10周后部分处死，眼球取血，测定ALT、AST、GGT 。取肝脏左叶同一部位组织，4%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE及苏丹Ⅲ染色，光镜下观察病理形态。取肝脏右叶组织4℃下制备肝匀浆，考马斯亮蓝法测定匀浆蛋白，GSH-PX、SOD、MDA、GSH、H2O2测定按试剂盒操作步骤进行。
3. RNA抽提和RT-PCR：肝脏总RNA提取和RT-PCR按Wats和TaKaRa试剂盒操作，PCR引物序列：CYP2E1：5′-TTTCCCTCTTCCCATCCT TG-3′，5′-ATTACCCTGTTTCCCCATTCC-3′；内对照亲环素Cyclophilin,CYC：5′-CTTCGAC ATCACGGCTGATGG-3′，5′-CAGGACCTGTAT GCTTCAGG-3′，美国生物医学中心基因库（GenBank）中检索。CYP2E1和CYC的PCR循环为：95℃预变性10min，（95℃ 60s，58℃55s,72℃ 60s）×27次循环，15g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，EB染色，分子量标准为DNAmaker DL2000，凝胶图像分析系统对RT-PCR产物电泳条带行密度分析，测定目的带及CYC条带的V值（Volume=平均吸光密度值×条带面积），目的条带表达强度RV=V目的带/CYC。
4. Western blot：取肝右叶组织200mg，按申能博彩组织蛋白提取试剂盒说明书操作，上清液进行冷冻干燥24h，含蛋白酶抑制剂的PBS 60μl稀释蛋白沉淀，考马斯亮蓝法定量，取70μg蛋白，变性，行聚丙酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维膜，6%脱脂奶粉封闭1～2h，4℃冰箱过夜，洗涤后膜与兔抗鼠CYP2E1抗体（1∶200）作用1h，洗涤后加入二抗（抗兔HRP-IgG 1∶5000）反应1h，化学发光试剂检测，X光片显影。
5. 统计学分析：计量资料以x-±s表示，数据经过SAS系统软件处理，采用方差分析，多组间两两比较采用SNK法，两组间两两比较用t检验，方差不齐用StatterWaite（t′）检验。
结 果
1. 一般情况：正常对照组大鼠在实验观察中均活跃，毛色光滑，质量持续增长，于5周和10周时各处死15只，无死亡。酒精组大鼠则反应迟钝，毛色晦暗，质量增长缓慢，5周和10周时各处死15只和14只，死亡6只。LBP预防组，质量增长稍显缓慢，毛色稍暗，5% LBP预防组5周和10周时各处死14只和13只，死亡3只，10% LBP预防组5周和10周时各处死15只和13只，死亡2只。各组大鼠均死于酒精误吸入气管窒息。
2. 肝脏病理形态：肝脏大体标本：正常对照组及各预防组肝脏呈红褐色，质地软，酒精组大鼠肝脏质地较韧，色泽较晦暗。
光镜下，HE染色，正常对照组见肝细胞以小叶中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶轮廓清晰，少数肝细胞内小空泡变性。10周酒精组大部分（12/14只）肝组织切片可见中央静脉周围肝细胞排列紊乱，小叶界限不清，肝细胞浆中见大小不等较广泛空泡变性，散在炎性细胞浸润（图1）。两个预防组10周时病理切片见肝小叶轮廓仍较清晰，肝细胞排列呈放射状，仅在肝腺泡Ⅲ区排列稍显紊乱，肝细胞内空泡变性较酒精组明显少，以小空泡为主，以5% LBP预防组为代表（图2）。
光镜下，10周冰冻切片苏丹Ⅲ染色，正常对照组呈红色的脂肪颗粒极少，酒精组肝细胞内大量呈红色的脂肪滴（图3），药物预防组则明显减少，接近正常对照组（图4）。含脂肪滴肝细胞所占面积评分标准如下：0分：含脂肪滴肝细胞散在、稀少；1分：含脂肪滴肝细胞≤1/4；2分：含脂肪滴肝细胞≤1/2；3分：含脂肪滴肝细胞≤3/4；4分：肝组织几乎被脂肪滴所代替，其面积>3/4。各组大鼠10周肝脏病理苏丹Ⅲ染色脂肪变程度积分比较：正常对照组15只为0.8±0.6，酒精组14只为3.1±0.6，较对照组脂肪变程度积分明显升高；5%和10% LBP预防组各13只分别为1.7±0.6和1.5±0.9，均较酒精组脂肪变程度积分明显降低，但仍与正常对照组有差异，F＝24.01，P<0.01。
3. 各组大鼠血清肝功能测定结果：见表1。
4. 各组大鼠10周脂质过氧化酶学测定结果：见表2。
5. RT-PCR检测各组大鼠CYP2E1/CYC mRNA变化：CYP2E1基因表达，5周5% LBP预防组为0.39±0.04,10% LBP预防组为0.40±0.06；10周5% LBP预防组为0.41±0.05，10% LBP预防组为0.42±0.08，酒精组5周和10周分别为0.74±0.05和1.02±0.08。两预防组、酒精组与正常对照组比、两预防组与酒精组比，F值分别为496.44和672.69，P<0.01。
CYP2E1蛋白表达水平, 5周5% LBP预防组为3.49±0.36, 10% LBP预防组为3.29±0.30, 10周5% LBP预防组为3.58±0.30，10% LBP预防组为3.36±0.37，酒精组5周和10周分别为5.63±0.44和7.90±0.26，两预防组比酒精组显著降低，F值分别=217.26和790.21，P<0.01，差异有统计学意义。见图5，图6。
6. Western blot检测各组CYP2E1蛋白表达：每组随机抽取8份肝标本进行检测，各组CYP2E1蛋白表达见图7。
讨 论
本实验结果显示，随乙醇摄入增加，大鼠肝脏脂肪变程度逐渐加重， CYP2E1基因和蛋白表达也逐渐增高，其增高与乙醇摄入呈明显量效关系。证实了长期慢性乙醇摄入对肝脏的损伤主要是通过微粒体氧化酶系统，乙醇提高其关键酶CYP2E1的基因和蛋白表达，使反应性氧增多，自由基生成增加，激活磷脂酶及脂质过氧化反应，抑制SOD、GSH-PX活性，消耗氧自由基清除剂GSH，使脂质过氧化产物MDA及H2O2显著升高，破坏蛋白质结构和功能，形成AFL[5，6]。本实验还证实了AFL大鼠CYP2E1蛋白表达增强与其基因表达上调相一致，表明是在转录水平上发挥的作用。
使用生物抗氧化剂切断过氧化链式反应可以抑制机体的自由基损伤，多糖可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少链式反应的长度，阻断或减慢脂质过氧化的进行。有实验表明LBP明显清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应[7]，宋育林等[1]证实LBP可以治疗酒精性肝病。但在酒精持续对机体造成损伤的情况下，LBP是否也能发挥抗氧化作用尚不明确。本实验用LBP与乙醇同时灌胃作为预防组，与酒精组、正常对照组比较，结果表明LBP在大鼠体内能有效抑制CYP2E1基因和蛋白表达，提高SOD、GSH-PX活性，使H2O2在体内迅速被清除，GSH消耗减少，从而降低脂质过氧化作用，使MDA含量下降，保护肝细胞，降低血清肝酶谱，即使在酒精的损伤因素持续存在的情况下，仍能有效减轻肝脏脂肪变性。
有学者发现LBP在减轻CCl4至肝损伤中表现出一适宜剂量[4]，这可能与多糖化合物中有多种成分及复杂的分子结构有关。由于时间和经费的限制，本实验仅设5%和10%两种LBP剂量，尚未表现出量效关系，下一步可多设定几个剂量，以寻求LBP预防AFL的最适剂量，并进一步对LBP进行纯化，提取单体，探明分子结构，深入研究。
总之，本实验证实了LBP能有效预防乙醇所至大鼠肝脏脂肪变性，其抑制CYP2E1基因和蛋白表达，抗氧化应激作用是其预防与自由基相关的AFL的主要机制。
参 考 文 献
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