【摘要】 目的 探讨脂联素（ADPN）是否对肝脏的免疫性损伤具有保护作用以及可能的作用机制。 方法 将小鼠ADPN基因高效表达载体导入小鼠体内，获得高血清ADPN模型小鼠（表达载体组），与导入空载体的对照小鼠（空载体组）同时静脉内注射刀豆球蛋白A（Con A），以诱导肝脏的免疫性损伤，测定不同时间点血清ALT浓度，并进行肝组织病理学检查（HE染色），观察两组小鼠肝脏损伤程度是否有差异。比较两组间血清TNFα浓度的不同，探讨可能的作用机制。 结果 表达载体组小鼠注射Con A后血清ALT水平的升高明显低于空载体组，差异有统计学意义（P<0.01），组织学检查也显示表达载体组小鼠的肝损伤明显低于空载体组。经统计分析表明，ALT水平与血清ADPN水平成负相关（r＝-0.5034，P＝0.0121）。表达组小鼠血清TNFα水平明显低于空载体组（P<0.01）。 结论 脂联素对Con A诱导的肝脏免疫性损伤具有保护作用，其作用机制可能与抑制TNFα的产生进而阻断肝细胞遭受免疫性攻击有关。
【关键词】 肿瘤坏死因子α； 脂联素； 刀豆球蛋白A
The protective role of adiponectin in Con A-induced mouse liver injury WANG Hui-zhong, LIN Hu, GAO De-lu, ZHAN Lin-sheng, WANG Quan-li. Geriatrics Center, PLA 305 Hospital , Beijing 100017, China
【Abstract】 Objective To evaluate the role of adiponectin in regulating tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) production and preventing fulminant autoimmunological damage of hepatocytes following concanavalin A (Con A) injection into mice. Methods Three days after recombinant plasmids pAA-neo-mAd were injected into the mice via the tail veins, Con A was injected into the mice. Mice transfected with empty pAA-neo vector served as controls. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT), TNF alpha and adiponectin were detected, and histological examination of livers was carried out at different time points after the Con A injection. All results were subjected to statistical analyses. Results Histological examinations showed that the damage in livers of mice with high serum adiponectin levels was milder than that of the controls. The serum levels of ALT and TNF alpha were both lower than those of the controls (P < 0.01, respectively). Statistical analyses showed the serum levels of ALT was negatively related to the levels of adiponectin in the sera (r = -0.5034). Conclusion Adiponectin is effective in protecting hepatocytes from Con A-induced immunological injury. The mechanism of this protective effect may be caused by inhibiting the synthesis and/or release of TNF alpha.
【Key words】 Tumor necrosis factor; Adiponectin; Concanavalin A
脂联素（adiponectin，ADPN）通过抑制TNFα的产生及其作用的发挥，在实验性肝损伤中发挥了保护作用[1-3]。本研究采用静脉注射刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）的方法对不同血清ADPN浓度的小鼠诱发免疫性肝损伤，通过测定血清ALT浓度以及肝组织病理学检查，观察不同ADPN水平的小鼠在注射Con A后其肝损伤程度是否有差异，并观察血清ADPN水平与TNFα的升高程度是否相关，以探讨其可能的作用机制。
材料与方法
1. 实验动物及分组：6～8周龄、体重约20g的雌性BALB/c小鼠60只购自军事医学科学院实验动物中心。将其分为表达载体组和空载体组各30只。采用流体动力技术，表达载体组注入表达载体pAA-neo-mAd，空载体组注入空载体pAA-neo。注射方法参照文献[4]，将表达载体质粒溶于等渗盐水，通过尾静脉注入小鼠体内；同时每只小鼠的注射体积（ml）为小鼠体重（g）的1/10，注入质粒量为100μg，注射过程在5～8s内完成。
2. 试剂与仪器：Con A（Ⅳ型）为美国Sigma公司产品（货号：c2010），血清ALT定量仪器及试剂为日本Olympus公司全自动生化分析仪（型号:AU600）及配套试剂（速率法），小鼠血清ADPN定量ELISA试剂盒为美国LINCO公司产品（货号：#EZMADP-60K），小鼠TNFα定量EIA试剂盒购自美国Genzyme公司。ADPN真核表达载体pAA-neo-mAd由王会中等[5]构建。
3. Con A诱导小鼠肝损伤及样品采集：表达载体注射3d后（预实验显示，由于转染时高流体压力的冲击，在注射后第1天小鼠出现了肝组织疏松、肝细胞肿胀、血清ALT水平升高等肝损伤的表现，但3d后基本恢复正常，这与Zhang等[4]报道一致），两组小鼠均通过尾静脉给予剂量为10mg/kg体重的Con A。于注射Con A后4、12、24、48h采集血样及肝脏组织（每时间点每组各取3只小鼠），血清分离后置-20℃冻存，肝脏置4%甲醛溶液中固定。
4. 血清ADPN、TNFα、ALT浓度的测定及肝组织病理学检查：将每份血清分别进行ADPN、ALT、TNFα三项指标的定量检测。血清ALT浓度由全自动生化分析仪测定。血清中ADPN和TNF α浓度的测定均使用定量ELISA试剂盒，操作步骤按试剂盒说明书要求。ADPN试剂盒的检测低限是0.5ng/ml，TNFα定量EIA试剂盒的检测灵敏度为25ng/L。固定好的肝组织石蜡包埋，5μm厚切片，常规HE染色，显微镜下观察。
5. 统计学方法: 所有统计分析使用SAS软件处理。计量资料以均数±标准差表示，两组间差异比较采用两因素析因设计的方差分析，相关性采用Pearson相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
结 果
1. 血清ADPN浓度：注射Con A后，两组小鼠不同时间点血清ADPN定量结果见表1。重组ADPN在小鼠体内得到了比较稳定、高效的表达。
表1 两组小鼠注射刀豆球蛋白A后不同时间点血清
脂联素浓度（mg/L，x-±s）
组别 4h 12h 24h 48h
空载体组 9.37±1.45 10.34±1.41 9.22±1.86 9.14±0.82
表达载体组 46.11±6.69 39.91±3.93 34.56±4.64 30.18±8.46
注：F＝235.71，P＜0.01
2. 血清ALT浓度:两组小鼠注射Con A后不同时间点血清ALT测定结果见表2。和正常浓度相比，虽然两组小鼠均出现了血清ALT浓度大幅升高，但表达载体组升高的幅度明显低于空载体组。
表2 两组小鼠注射刀豆球蛋白A后不同时间点血清ALT浓度（U/L，x-±s）
组别 4h 12h 24h 48h
空载体组 1799±205 3193±369 5800±232 544± 92
表达载体组 780±131 1300±166 1614±180 367±131
注：F＝472.22，P＜0.01
3. 肝组织病理学检查:注射Con A 4h后的肝脏大体标本可见，空载体组小鼠肝脏淤血变暗，而表达载体组肝脏鲜红光润。肝组织病理切片经HE染色后光学显微镜下可见，表达载体组小鼠比空载体组的肝脏损伤明显减轻（图1）。空载体组在注射Con A 4h后，肝细胞即出现变性改变，肝细胞肿胀，胞浆疏松，细胞结构不完整，肝窦内红细胞淤积（图1A）；24h后，门静脉区和中央静脉区可见大量淋巴细胞、多叶核粒细胞浸润，肝细胞损伤进一步蔓延加重，细胞核破损，细胞浆出现囊性或空泡样改变（图1B）；48h后，肝脏出现灶状，甚至团块状坏死区，坏死区外周可见炎性细胞浸润（图1C）。表达载体组的小鼠在注射Con A后，其肝脏的损伤程度较低，4h后，肝细胞形态变化不明显（图1D）；24h后，汇管区可见少量淋巴细胞浸润，部分肝细胞损伤有所加重，细胞浆出现空泡样改变，但细胞核完整（图1E）；48h后，细胞损伤未见进一步加重，肝脏内未见坏死区（图1F）。
4. 血清ALT与ADPN水平之间的相关性：注射Con A后两组小鼠不同时间点血清ALT与ADPN浓度之间的相关性经Pearson相关分析得出，二者之间呈负相关（r＝-0.5034，P＝0.0121< 0.05）。血清ADPN浓度越高，肝脏所受损伤程度越低。
5. 血清TNFα浓度及其与ADPN浓度之间的相关性：两组小鼠血清TNFα浓度测定结果，见表3。根据方差分析的需要，所有低于检测低限的值均计为25μg/L。未发现血清TNFα浓度与ADPN浓度之间有相关性。
表3 小鼠血清TNFα浓度测定结果（μg/L，x-±s）
组别 4h 12h 24h 48h
空载体组 580.6±42.2 177.9±18.7 <25 <25
表达载体组 203.7± 5.2 57.0±12.4 <25 <25
注：F＝297.16，P＜0.01
讨 论
Con A诱导的肝损伤模型由于其病理生理特点与人急性肝炎相似，且方法简便、快速，因此被广泛应用于自身免疫性肝炎及病毒性肝炎的研究中。Con A与肝细胞浆膜有极强的亲和性，注入体内后大量聚集在肝脏，招募并激活T淋巴细胞（主要是CD4+细胞）以及库普弗细胞，释放多种细胞因子，产生针对肝细胞的细胞毒效应。
本研究通过流体动力技术获得了ADPN基因在肝脏内高效表达[4]。注射表达载体的小鼠其血清ADPN浓度明显高于注射空载体以及等渗盐水对照的小鼠。在此基础上，我们进行了Con A诱导肝细胞免疫性损伤实验，以观察ADPN是否具有肝细胞保护作用。由于作为非相关对照的等渗盐水组与注射空载体组小鼠在注射Con A后血清ALT的升高程度以及血清ADPN水平上几乎无差别，因而本研究中仅选择了空载体组作为阴性对照。
本实验结果显示，注射Con A后高ADPN水平的表达载体组小鼠血清ALT浓度的升高明显低于对照小鼠，经统计学分析两组间ALT水平差异具有统计学意义（P＜0.01），经相关性分析显示，ALT浓度与ADPN浓度呈负相关（P＜0.05）。结果提示：血液中ADPN水平越高，肝脏损伤程度越轻，高水平的ADPN对Con A诱导的免疫性肝损伤具有保护作用。 注入Con A后表达载体组小鼠血清TNFα的升高幅度明显低于空载体组（P＜0.01）。结果提示：ADPN对肝细胞的保护可能是通过抑制TNFα的产生而起作用的。虽然本研究中未发现TNFα与ADPN水平之间有很好的相关性（可能与TNFα统计学上计量个数偏少有关），但仍可以看出高水平ADPN能有效抑制血清TNFα的升高。本研究结果初步表明ADPN对Con A诱导的免疫性肝损伤具有保护作用，可能与抑制TNFα的产生有关，但其保护作用的具体分子机制还有待于进一步探讨。
参 考 文 献
[1]Masaki T, Chiba S, Tatsukawa H, et al. Adiponectin protects LPS-induced liver injury through modulation of TNF-alpha in KK-Ay obese mice. Hepatology, 2004, 40: 177-184 .
[2]Xu A, Wang Y, Keshaw H, et al. The fat-derived hormone adiponectin alleviates alcoholic and nonalcoholic fatty liver diseases in mice. J Clin Invest, 2003, 112: 91-100.
[3]Kamada Y, Tamura S, Kiso S, et al. Enhanced carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice lacking adiponectin. Gastroenterology, 2003, 125: 1796-1807.
[4]Zhang G, Budkar V, Wolff JA. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther, 1999, 10: 1735-1737.
[5]Wang HZ, Fu QX, Chen JX, et al. Efficient and stable expression of adiponectin in mouse liver. Junshi Yixue Kexueyuan Yuankan, 2005, 29: 439-443.
王会中,付秋霞,陈竞新,等.脂联素在小鼠肝脏的高效稳定表达.军事医学科学院院刊，2005,29:439-443.
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