【摘要】 目的 构建TIMP-1小干扰RNA（siRNA）真核表达载体并观察其对肝星状细胞株TIMP-1 mRNA表达的作用。 方法 根据siRNA设计原则，在TIMP-1 mRNA序列中选择2个特异性靶序列 (447～465nt、552～540nt)及1条无关对照序列；体外合成对应发卡样DNA片段，将其克隆入pGEM-T连接载体，BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pGEM-T及表达载体pRNAT-U6.2，胶回收粘末端将特异序列定向亚克隆构建TIMP-1 pRNAT-U6.2/siRNA载体，用脂质体包裹转染入T6细胞，采用RT-PCR检测TIMP-1 mRNA表达水平的变化。 结果 所构建的TIMP-1 pRNAT-U6.2/siRNA载体,经酶切鉴定与测序,结果显示特定位点靶序列与设计序列完全一致；转染T6细胞后，TIMP-1 mRNA表达明显降低。 结论 成功构建TIMP-1 siRNA载体TIMP-1 pRNAT-U6.2/siRNA，转染T6细胞可以有效抑制TIMP-1 mRNA的表达。
【关键词】 肝纤维化； 基质金属蛋白酶抑制因子1； RNA干扰
Construction and identification of matrix metalloproteinal inhibitor-1 siRNA eukaryotic expression vectors TIAN Li*, LI Ji-chang, ZHAO Guo-qiang, CHEN Kui-sheng, FAN Wen-hui, LOU Xin, SUN Miao-miao, CAO Xue-quan. *Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China
【Abstract】 Objective To construct TIMP-1 siRNA eukaryotic expression vectors and evaluate their effect on TIMP-1 mRNA expression in hepatic stellate cells. Methods The combinant lone DNA with cutting sites of BamH I and Xho I enzyme according to the sequences of 447-465, 552-540 TIMP-1 of rats and nonspecific sequence were selected and cloned to pGEM-T vector and sub-cloned to pRNAT-U6.2. They were then identified by double enzyme digestion analysis and DNA sequencing. Three plasmids were transfected into T6 separately through an oligofectamine package. TIMP-1 mRNA expression was evaluated by RT-PCR. Results Targeting sequences of TIMP-1 siRNA eukaryotic expression vectors were correct. TIMP-1 mRNA expression was significantly reduced by transfecting them into the T6. Conclusion We successfully constructed two TIMP-1 siRNA eukaryotic expression vectors and the transfected cells can significantly suppress the TIMP-1 expression.
【Key words】 Liver fibrosis; Matrix metalloproteinal inhibitor-1; RNA interference
TIMP-1是近年发现的MMPs天然抑制剂,TIMP-1与肝纤维化形成关系密切[1]。阻逆肝纤维化研究策略中,一方面积极抑制胶原过度产生,另一方面应设法增强能特异降解ECM的MMPs活性,所以解除TIMP-1对MMPs的抑制就成为肝纤维化基因逆转治疗研究的关键。RNA干扰（RNAi）技术以其能定向、高效、特异敲除靶基因的特点备受关注。我们针对大鼠TIMP-1设计构建其小干扰RNA（siRNA）真核表达载体并转染到T6细胞, 研究该表达载体的抑制效果。
材料与方法
1. 主要试剂和仪器：pRNAT-U6.2购自美国GeneScript公司，大肠杆菌JM109、限制性内切酶、T4 DNA连接酶，T载体（pGEM-T）购自美国Promega公司, 大鼠HSC株T6为上海中医药大学刘成海教授惠赠;胎牛血清购自美国Hycolone公司;脂质体LipofectAmineTM 2000, G418, Trizol试剂、RT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；凝胶成像系统（SYNGENE）美国Gene公司。
2. 靶向TIMP-1基因的寡核苷酸设计：将编码大鼠TIMP-1的mRNA序列输入美国GeneScript公司的在线siRNA设计软件siRNA Target Finder, 软件自动分析和显示候选siRNA并最终设计出插入片段。2组特异性靶序列：447～465nt（S11、12）、552～540nt（命名为S21、22)，同时设计1组无关对照序列（M1、M2）。3组序列由反义链,正义链、反向互补序列和环（loop）组成, 并在3′端加入了终止信号TTTTTT，两端分别加入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点。6条寡核苷酸由上海生工生物工程公司合成（表1）。
3. 发卡样DNA片段退火：将合成的寡核苷酸S11、S12, S21、S22, M1、M2分别溶解在50μl H2O中, 终浓度为2μg/μl；S11和S12各取2μl，S21和S22, M1和M2各取2μl，分别与36μl退火缓冲液混合，95℃孵育4min，70℃孵育10min, 缓慢冷却至4℃即完成寡核苷酸的退火。
4. 退火寡核苷酸与T载体连接：4.2×反应缓冲液5μl，T4连接酶1μl，T载体（pGEM-T）1μl，退火后的寡核苷酸3μl，4℃过夜。按常规操作方法连接并将重组载体转化感受态细胞JM109，用T7和SP6为引物进行PCR鉴定，得到pGEM-T-S1、pGEM-T-S2和pGEM-T-M。
5. 发卡DNA片段与pRNAT-U6.2的连接：BamHI和XhoI分别双酶切pGEM-T-S1、pGEM-T-S2、pGEM-T-M和pRNAT-U6.2，胶回收双粘TIMP-1靶向发卡DNA片段S1、S2，对照无关发卡DNA片段M以及粘末端线性siRNA载体pRNAT-U6.2；2×反应缓冲液5μl，T4连接酶1μl，粘末端线性siRNA载体pRNAT-U6.2 1μl，发卡DNA片段S1（或S2，或M）3μl，4℃过夜。按常规操作方法连接并将重组载体转化感受态细胞JM109，用pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR鉴定，阳性重组质粒送到上海生工生物工程公司测序。得到靶向TIMP-1的发卡DNA片段与pRNAT-U6.2连接重组载体分别命名为pRNAT-U6.2-TIMP447, pRNAT-U6.2-TIMP552，对照的发卡DNA片段与pRNAT-U6.2连接重组载体命名为pRNAT-U6.2-M。提取质粒备用。
6. 细胞培养及转染：大鼠HSC株T6培养于含15%胎牛血清DMEM培养液中,待细胞密度长至约80%时,进行脂质体介导的pRNAT-U6.2-TIMP447，pRNAT-U6.2-TIMP552和pRNAT-U6.2-M DNA转染，G418筛选2～3周，挑取单克隆，扩大培养。
7. RT-PCR：检测TIMP-1表达引物，正义: 5′-GCTCAAAGGATTCGACGCTG-3′；反义: 5′-GGCAGGCAAAGTGATCGCTC-3′；使用Trizol提取转染筛选后细胞RNA，RT-PCR按试剂盒说明书进行，同时扩增β-actin cDNA为内参照, PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳。
结 果
1. 退火寡核苷酸与T载体的连接鉴定：TIMP-1和对照发卡样siRNA单链DNA退火产物与pGEM-T Easy连接后，转化JM109，蓝白筛选后随机各选择5菌落, 以T7/SP6作为引物进行PCR扩增，均得到247bp扩增片段的的阳性克隆（发卡样siRNA单链DNA退火产物序列71bp加上pGEM-T Easy中T7启动子与SP6启动子之间的碱基数176bp），见图1。
2. 发卡DNA片段与pRNAT-U6.2的连接鉴定：转化JM109后都得到10个以上的克隆，各随机选择菌落, 用pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR扩增，均得到约550bp扩增片段的阳性克隆，见图2。
3. 阳性重组pRNAT-U6.2载体DNA序列分析：重组的阳性载体pRNAT-U6.2-TIMP447、pRNAT-U6.2-TIMP552测序的结果，与设计靶向TIMP-1 (447～465nt、552～540nt)的寡核苷酸序列比较结果完全一致；重组非特异对照载体pRNAT-U6.2-M测序的结果，与设计的非特异对照的寡核苷酸序列比较结果完全一致，成功构建出靶向TIMP-1的siRNA表达载体和非特异对照载体。
4. RT-PCR结果：用上述重组pRNAT-U6.2-TIMP447, pRNAT-U6.2-TIMP552载体及pRNAT-U6.2-M载体分别转染大鼠HSC株T6,转染细胞挑取单克隆，经RT-PCR检测TIMP-1基因表达情况,其中pRNAT-U6.2-TIMP447，pRNAT-U6.2-TIMP552转染组细胞TIMP-1的PCR产物的量显著降低,表明细胞中TIMP-1 mRNA被有效降解，见图3。
讨 论
TIMP-1是阻止或逆转肝纤维化一个重要靶标。RNAi是双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达使其转录后沉默的过程[2]。RNAi技术是通过核酸酶将双链RNA(dsRNA)切割成21～25nt的干扰性小RNA，即siRNA，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现靶基因定向敲除作用[3]。本课题以TIMP-1为靶基因筛选出位点为447～465nt、552～540nt的两条定点敲除的靶序列作为表达载体pRNAT-U6.2的特异性插入序列。pRNAT-U6.2是一新型高效真核表达载体，具细胞核内转录小核RNA U6.2（snRNA U6.2）的作用原件，可准确地启动和终止转录信号,有效限制被转录RNA片段的大小[4],抵抗引起干扰素的非特异作用,而且该表达载体具SV40启动子，可使所构建的载体在真核细胞内进行复制,增加细胞内siRNA转录的模板数,以增强、加快和延长RNAi的效应。构建过程中，首先合成筛选出的两条TIMP-1特异单链寡核苷酸片段，退火后与克隆载体连接、扩增，用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pGEM-T和pRNAT-U6.2，将酶切下的pGEM-T插入片段与相对应的pRNAT-U6.2粘端线性连接，将其转化感受态细胞JM109，经pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR鉴定，证实插入片段与设计序列相同，保证TIMP-1的特异性。转染试验证明，用TIMP-1的特异性siRNA转染T6细胞,可定点敲除TIMP-1基因表达，但两条特异靶序列抑制基因表达的效率显著不同，靶位为447～465nt的抑制效率较高。可能由于不同的siRNA靶序列与TIMP-1 mRNA序列上的结合蛋白成分产生不同位置效应而致抑制效果不同[5]。提示多靶点重组载体构建并协同转染细胞或组织能更高效率或完全意义的敲除TIMP-1基因的表达。TIMP-1 pRNAT-U6.2/siRNA在细胞内进行转录后抑制，切割靶基因成为无功能的小片段，达到抑制TIMP-1基因表达的作用，为进一步将其转染肝纤维化大鼠抑制肝组织内TIMP-1表达并观察MMPs抑制解除后纤维化肝组织的胶原纤维重构奠定了基础，为寻找治疗肝纤维化的方法提供了新的思路及实验依据。
参 考 文 献
[1]Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinase structure,function,and metastasis. Circ Res,2003, 92: 827-830.
[2]Song E, Kyung JS, Wang J, et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med, 2003, 9: 347-351.
[3]Matzke M, Matzke AJ, Kooter JM. RNA: guiding gene silencing.Science, 2001, 293: 1081-1083.
[4]Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotechnol, 2002, 20: 497-500.
[5]Luo KQ, Chang DC. The gene-silencing efficiency of siRNA is strongly dependent on the local structure of mRNA at the targeted region. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 318: 303-310.
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