【摘要】 目的 探讨携带多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）反义RNA重组腺病毒载体在裸鼠体内逆转肝癌多药耐药细胞HepG2/阿霉素（adriamycin，ADM）的疗效及作用机制。 方法 构建携带AFP和asmdr1的重组腺病毒载体Adeno-asmdr1，ADM分级诱导肝癌细胞HepG2为多药耐药细胞HepG2/ADM，建立HepG2/ADM裸鼠皮下移植瘤模型，Adeno-asmdr1局部注射，观察移植瘤的体积、透射电镜检测移植瘤组织细胞凋亡、RT-PCR检测MDR1转录水平，评价Adeno-asmdr1的抗肿瘤活性。 结果 在Adeno-asmdr1＋ADM组，移植瘤体积无增大，而PBS组、ADM组体积明显增大；RT-PCR检测移植瘤细胞1周和4周MDR1 mRNA水平，ADM组无明显变化，Adeno-amdr1＋ADM组在4周时MDR1转录水平仅为单纯ADM组的20%，经ADM＋Adeno-asmdr1处理组，可见凋亡增加，ADM组和PBS处理组的裸鼠移植瘤组织中出现少量或没有凋亡。 结论 携带MDR1反义RNA重组腺病毒部分逆转HepG2/ADM的多药耐药，阻止肿瘤生长，下调MDR1转录水平，导致肿瘤细胞凋亡。
【关键词】 癌，肝细胞； 基因，MDR； 腺病毒，人； 基因疗法； RNA，反义
Reversal of adriamycin resistance of hepatocellular carcinoma by targeting it with recombined adenovirus carrying antisense multidrug resistance gene 1 RNA MEI Ying, SHI Yu-jun, DING Xiong, WU Chuan-xin, JIAN Hua-gang, GONG Jian-ping, LIU Chang-an. Second Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China
Corresponding author: LIU Chang-an,
【Abstract】 Objective To investigate if an adenovirus vector carrying antisence multidrug resistance gene 1 (MDR1) could reverse multidrug resistance (MDR) of HepG2/ adriamycin (ADM) cells in tumors transplanted in athymic mice. Methods An adenovirus vector carrying AFP promoter and antisence MDR1 was constructed. HepG2 MDR cells (HepG2/ADM) were induced by graded resistance to ADM and were subcutaneouly inoculated into athymic mice to construct the transplanted tumor. After adeno-asmdr1 was injected, the volume of the transplanted tumor and the apoptotic body in the xenograft tumor cells were observed and reverse transcriptase polymerase chain reaction was employed to investigate the expression of the mdr1-mRNA from the mouse transplanted tumor cells. Results Following injection with adeno-asmdr1, the tumor volumes in this mice group did not increase. However the tumor volume in the PBS plus ADM group did increase significantly (P < 0.05). In the tumor xenograft cells, mdr1 mRNA in the xenografts was assessed by RT-PCR and found to be reduced at week 1, and at week 4 in the ADM+asmdr1 group, but it was stable in the ADM group. It was only 20% in the ADM+asmdr1 group compared to the ADM group at the 4th week (P < 0.05). Evidence of apoptosis was observed in the tumor xenograft cells treated with adeno-asmdr1, but there was rarely any apoptosis in the group treated with ADM and PBS. Conclusion Adenovirus carrying antisense mdr1 RNA can partially reverse the MDR of HepG2/ADM cells and inhibit tumor growth by down-regulating mdr1 mRNA resulting in tumor cell apoptosis.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Genes, MDR; Adenoviruses, human; Gene therapy; RNA, antisense
原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中约90%为HCC[1]，目前的治疗方案是以手术为主的综合治疗。化疗被认为是除手术外治疗HCC的重要手段之一，然而多数患者化疗效果较差，即使经过最初的有效化疗，也难免复发和转移。研究证明肿瘤细胞的多药耐药性是肿瘤化疗疗效差的主要原因之一[2]。在肿瘤细胞多药耐药机制中，多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）的活化及产物P-糖蛋白170（P-glyco-protein，P-gp170）的过度表达占有重要地位[3]。本研究运用基因技术，构建携带MDR1反义RNA重组腺病毒封闭肝癌多药耐药细胞，下调P-gp170的过度表达，恢复肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，导致肿瘤细胞凋亡。
材料与方法
1．动物和试剂：Balb/c裸小鼠，雄性，4周龄，质量20～22g，购自中国科学院上海实验动物中心，代养于重庆医科大学动物实验中心（SPF级）。EX tap DNA聚合酶、T4连接酶、DNA提取试剂盒Wizard Genomic DNA Purification Kit、质粒抽提试剂盒Wizard PCR Preps DNA Purification System购自美国Promega公司；限制性内切酶、DNA分子量标记（mark）购自大连宝生物工程有限公司；转染试剂盒LipofectamineTM reagent购自美国Invitrogen公司；MTT、PBS购自美国Sigma公司，RPMI 1640、胎牛血清购自美国Hyclone公司，DMEM购自美国Gibco公司，小鼠抗人P-gp170购自美国Chemicon公司。
2. 细胞系和载体：人肝细胞肝癌细胞系HepG2由重庆医科大学病理生理学教研室汤为学教授惠赠；低传代人胚肾293细胞购自中科院上海细胞及生化研究所。所有细胞均在37℃、CO2体积分数5%、饱和湿度的孵箱中培养，当细胞贴满约90%面积培养瓶底时（3～4d）进行传代。Adeno-XTM Expression System购自美国Clontech公司。
3. 多药耐药细胞HepG2/阿霉素（adriamycin，ADM）的建立：HepG2细胞正常传代2～3代后，在DMEM培养液中加入ADM进行耐药细胞诱导，按培养瓶内ADM终浓度为0.01mg/L计算加入所需ADM的量， 当细胞存活率达到90%以上时，再进行下一梯度的耐药诱导，每个梯度逐次递加0.01mg/L，直至DMEM培养液内ADM终浓度达到2mg/L，保持90%的细胞存活率，同时可以进行正常传代、冻存和复苏，HepG2细胞停止耐药诱导，长期保存于含1mg/L ADM的DMEM培养基中。MTT法检测5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、丝裂霉素C（Mitomycin C，MMC）、氨甲蝶呤（methotrexate，MTX）及ADM化疗药物，计算其理论血峰值浓度（Cmax）的近似值，每种药物用注射用水配制、-20℃保存备用。用酶标仪测定波长490nm处的吸光度（A）值，计算3个复孔的平均A值，计算不同药物对HepG2/ADM和HepG2细胞的生长抑制率：肿瘤细胞生长抑制率（%）＝（A对照组－A实验组）/ A对照组×100%。
4. 重组腺病毒载体Adeno-asmdr1的构建：首先去除质粒pshuttle中的pCMV启动子；以PCR扩增pshuttle中99～744bp，引物由上海博亚生物公司合成，序列如下：上游5′-AGCCAGTATCTGCT CCCTGCTTGTG-3′，下游5′-ATGCTAGCGG TGCCAAAACAAACTCCCA-3′，在下游引物中引入NheⅠ酶切位点。该PCR扩增产物中MluⅠ位点位于pshuttle中256 bp，NheⅠ位于921 bp。将上述PCR产物以MluⅠ和NheⅠ进行双酶切，获取的酶切产物即为pshuttle中256～744bp，同样以此两酶对pshuttle进行双酶切，将pshuttle中256～921bp去除，回收后以T4连接酶连接两个酶切产物，于是将pshuttle中256～921bp替换为256～744bp，CMV启动子（744～921bp）即被去除。该质粒命名为pCMV-。将pCMV-与AFP启动子PCR产物均以MluⅠ和NheⅠ进行双酶切，并连接酶切产物。271bp的AFP启动子即被插入到pCMV-，命名为pAFP。CMV启动子被AFP启动子替换。从耐药细胞HepG2/ADM提取总RNA，经逆转录合成首条cDNA，然后进行PCR扩增从转录起始点开始200 bp的MDR1。将PCR产物于pAFP质粒同时以KpnⅠ和ApaⅠ进行双酶切后，以T4连接酶连接。这样即将MDR1转录起始位点后200bp片段反向插入pAFP，构建成pAFP-asmdr1质粒。将pAFP-asmdr1质粒分别以内切酶PI-SceⅠ和I-CeuⅠ进行双酶切，回收酶切产物。运用体外连接（in vitro ligation）方案，将酶切后的质粒亚克隆至腺病毒基因组Adeno-XTM，将连接产物以SwaⅠ酶切，去除未能重组的pAdeno-X DNA，将连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，挑选阳性克隆，提取足够量重组pAdeno-X DNA，以PacⅠ消化pAdeno-X DNA，使其线性化，转染人胚肾293细胞。按照终点稀释法测定出本实验病毒滴度约为1×107pfu/ml。
5. 荷瘤裸鼠模型建立：取生长良好的HepG2/ADM细胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS清洗2遍后，以1×108/ml重悬于PBS中，于每只正常Balb/c裸小鼠左前肢腋下皮下注射0.1ml，即注入1×107个HepG2/ADM细胞，7 d可观察到皮下移植瘤生成，成瘤率达到86%，14 d时瘤体直径可达到5～6mm，可用于实验。
6．重组腺病毒载体Adeno-asmdr1对裸鼠移植瘤的逆转录活性：选取18只荷瘤裸鼠（荷瘤2周），随机分成3组：PBS组、ADM（2mg/L）组和ADM＋Adeno-asmdr（2mg/L ADM、1×107pfu/ml Adeno-asmdr1）组，瘤体内分别多点注射PBS、ADM及ADM＋Adeno-asmdr1各0.1ml，每周1次。自瘤体内注射日起每3d测量一次瘤体长短径，连续观察4周，根据公式确定移植瘤体积。瘤体积＝（长径×短径2/2）mm3，透射电镜观察ADM＋Adeno-asmdr1处理组裸鼠移植瘤组织。
7．RT-PCR检测各组移植瘤细胞MDR1转录水平：应用Primer5软件设计RT-PCR反应的引物；MDR1上游：5′-ATGCTCGTGTTTGGAGA-3′；下游：5′-AGCCAGAACATTCTTCC-3′，产物510bp。β-actin作为内参照，由上海博亚生物公司合成，上游：5′-ACCACAGCTGAGGGAAATCG-3′；下游：5′-AGAGGTCTTTACGGATGT CAACG-3′，产物281bp。取RT-PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，在Doc Gel 2000（美国Bio-Rad公司产品）凝胶成像系统下成像并以Bio-Image Analysis System进行半定量检测，结果以A值×面积（S）表示。mRNA相对含量＝（A目的基因×S）/（Aβ-actin×S）。
8. 统计分析：实验采用SPSS10.0统计软件，数据以均数±标准差表示，组间差异比较采用方差分析。
结 果
1．ADM、5-FU、MMC和MTX对HepG2/ADM细胞和HepG2细胞生长抑制率的影响：ADM、5-FU、MMC和MTX 4种不同药物分别以1、10、20、30Cmax的浓度作用于HepG2/ADM和HepG2细胞。HepG2/ADM和HepG2细胞随着药物浓度的上升，生长抑制率也上升，两者的生长抑制率差异有统计学意义（F＝5.2，P＜0.05）。HepG2/ADM细胞在ADM药物浓度为1、10、20Cmax时，生长抑制率变化不大，但当药物浓度达到30Cmax时，其生长抑制率明显提高，达到（65.3±0.02）%；而5-FU、MMC和MTX在10Cmax时就出现了变化，且随浓度升高生长抑制率逐渐上升，至30Cmax时达到了很高的生长抑制率。此结果说明了高浓度（30Cmax）的ADM对HepG2/ADM细胞具有一定的抑制作用，而5-FU、MMC和MTX在10Cmax时就能明显观察到对HepG2/ADM细胞的生长抑制。HepG2细胞在药物浓度为1Cmax时，就观察到较强的生长抑制，当药物浓度达10Cmax和20Cmax时，细胞几乎表现出100%的生长抑制率，表明HepG2细胞对临床常用化疗药物敏感。见表1。
2．PBS、ADM、ADM＋Adeno-asmdr1对裸鼠移植瘤体积的影响：统计学分析表明ADM＋Adeno-asmdr1组与PBS组、ADM＋Adeno-asmdr1组与ADM组间差异有统计学意义（F＝4.5，P＜0.05）；PBS组与ADM组间差异无统计学意义（F＝1.1，P＞0.05）。PBS处理组裸鼠移植瘤体积未受影响，瘤体积继续增加，ADM处理组裸鼠移植瘤体积也为上升趋势但其增幅小于PBS组，而ADM＋Adeno-asmdr1组裸鼠移植瘤体积未观察到明显增大（图1）。透射电镜观察ADM＋Adeno-asmdr1处理组裸鼠移植瘤组织，可以观察到部分细胞呈现凋亡特征：细胞体积变小，胞质浓缩，染色质固缩、边集，呈块状，细胞周围可见凋亡小体形成（图2）。
3．RT-PCR检测MDR1转录水平：ADM＋Adeno-asmdr1处理组4周后移植瘤组织细胞内MDR1转录的水平较单纯AMD作用组明显下降； ADM＋Adeno-asmdr1处理1周和4周后的MDR1转录水平比较，可以观察到4周时的MDR1转录水平较处理1周时的转录水平有所下降；单纯ADM处理组，4周后 MDR1转录水平较1周时有轻度上调（图3）。半定量分析显示，ADM＋Adeno-asmdr1处理组作用4周时MDR1转录水平仅为单纯ADM组的20%。
讨 论
目前，化疗被认为是治疗HCC的一种重要方案，肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药是引起化疗失败的主要原因。临床用于逆转肿瘤细胞多药耐药的方案较多，如钙通道阻滞剂维拉帕米[4]、砷化合物[5]、喹宁[6]、萘啶类化合物[7]等，但这些药物不能达到理想的逆转P-gp170的作用，且本身具有很多的不良反应，临床应用受到限制。如果仅仅提高血药浓度，高浓度的抗肿瘤药物固然可杀死耐药的肿瘤细胞，但同时严重的药物不良反应，使患者不能耐受致化疗失败。Licht等[8]研究证实人MDR家族包括MDR1和MDR2，MDR1位于第7号染色体q21.1，是有功能的耐药基因；MDR2染色体位置与MDR1相邻，为无功能耐药基因，但它常与MDR1一起扩增，与MDR1具有同源性。肿瘤的基因治疗由于具有较强的可操作性，不良反应较小，是国内外许多实验室研究的重点，并且显示了很好的应用前景。
AFP已经在临床工作中作为检测HCC时广泛采用的血清学标志物。以往的研究发现，AFP调控序列全长为5.1kb[9]，而临近转录起始点处约300bp长度的序列即可达到启动下游基因转录的作用。Kanai等[10]报道以AFP为特异性启动子携带胞嘧啶脱氨酶基因的重组腺病毒载体可以在体内有效地将5-FU的前体药物5-氟胞嘧啶转化为5-FU，使裸鼠体内移植瘤体积减小，重量减轻。
实验发现，应用高滴度重组腺病毒载体Adeno-asmdr1（1×107pfu/ml）联合ADM瘤体内多点注射，每周1次，连续注射4周，经RT-PCR证实，可下调移植瘤组织细胞内MDR1转录；而单纯经ADM组处理移植瘤组织细胞内MDR1转录是上升的。成组对照实验观察到，2mg/L的ADM对裸鼠移植瘤无明显抑制作用，移植瘤组织仍可继续生长，体积增大，重量增加，而在ADM联合Adeno-asmdr1处理组中观察到移植瘤体积未明显增大，早期可检测到明显的细胞凋亡，而至后期则在瘤体内可见大面积坏死组织，与单纯AMD及PBS对照组比较，移植瘤体体积差异有统计学意义，表明经Adeno-asmdr1处理后，可明显恢复移植瘤细胞对ADM敏感性，证实重组腺病毒载体Adeno-asmdr1可有效逆转肿瘤细胞多药耐药。
重组腺病毒载体Adeno-asmdr1联合ADM处理移植瘤7d后，移植瘤组织出现大量的细胞凋亡，透射电镜也观察到肿瘤细胞内有大量的凋亡小体，而30 d后肿瘤组织主要以细胞坏死为主，这与药物作用有直接关系。Schaich等[11]研究凋亡调节基因Bcl-2家族及BAX基因在肿瘤化疗耐药当中的表达，结果显示这些基因的表达水平与MDR1的表达水平有关，Bcl-2基因为重要的凋亡抑制基因，在大多数恶性肿瘤发生发展过程中被上调表达。同样，多数肿瘤具有原发性多药耐药表型，在化疗进程中被进一步上调。因此，MDR1与Bcl-2基因可能存在某种密切联系，即MDR1可能同样具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用。单纯封闭MDR1的表达能否直接诱导肿瘤细胞的凋亡，在本实验中未进行探讨，在以后的工作中值得进行深入研究。
实验证实运用携MDR1反义RNA重组腺病毒载体在动物体内可部分逆转HepG2/ADM细胞的多药耐药性，与单纯ADM处理组比较，肿瘤被更明显地抑制。细胞实验和体内实验均证实，该重组腺病毒载体并不能完全逆转其多药耐药，原因可能有：（1）参与多药耐药的基因并不只有MDR1，多药耐药相关蛋白基因MRP等同样具有重要作用[12, 13]；（2）反义技术本身仍然存在许多疑惑，尚待进一步研究，目前的基因封闭技术都难以达到对靶基因的完全封闭[14, 15]；（3）瘤体内的重组腺病毒有效滴度可能不足，不能完全阻断MDR1的转录，减低P-gp170的表达；（4）AFP特异性启动子启动效率有限，不能完全有效地启动其下游基因的转录；（5）本实验观察期较短，Adeno-asmdr1对移植瘤多药耐药的逆转作用及在AMD干预下的后续效应未能进行检测，有待今后深入研究。
参 考 文 献
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