【摘要】 目的 探讨IFN诱导的粘病毒抵抗蛋白A（MxA）和真核细胞起始因子2α调节区2（eIF-2α-reg2）基因的单核苷酸多态性（SNP）与CHB患者IFN治疗效果的关系。 方法 采用前瞻性研究方法，262例CHB患者签署知情同意书后予IFNα治疗12个月，随访至停药后6个月时评价疗效，分为持续应答和非持续应答。应用PCR及限制片段长度多态性的分析方法，检测患者MxA启动子-88、-123位点及eIF-2α-reg2的SNP，并比较SNP与IFN疗效的关系。 结果 262例CHB患者IFN治疗的应答情况为持续应答50例（19.1%），非持续应答212例（80.9%）。MxA启动子-88位点(G/T)，GG型患者与GT型CHB患者IFN疗效比较，差异有统计学意义（OR 5.3，95%置信区间2.46～11.43，P<0.01）；TT型与GT型患者的疗效比较，差异有统计学意义（OR 4.1，95%置信区间1.86～9.09，P<0.01）。MxA 启动子-123位点（C/A）、eIF-2α-reg2位点（A/G）各基因型及MxA启动子-88与-123组成4种可能的单体型患者IFN疗效比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论 MxA启动子-88位点为GT基因型的CHB患者对IFN治疗反应好，可作为IFN疗效的预测指标。
【关键词】 肝炎，乙型，慢性； 干扰素； 粘病毒抵抗蛋白A； 多态性，单核苷酸； eIF-2
Genetic polymorphisms of MxA protein and eIF-2α-reg2 and their responses to interferon treatment in patients with chronic hepatitis B HUANG Yan-xiang, MA Li-na, CHEN Xin-yue, LI Zhuo, HUANG Yun-li, SHEN Cheng-li, MA Bing. Beijing You抋n Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100069, China
Corresponding author: CHEN Xin-yue,
【Abstract】 Objectives To identify the host single nucleotide polymorphisms (SNP) of myxovirus resistance A (MxA) protein and eukaryocyte initiation factor 2alfa regulatory region 2(eIF-2α-reg2) and to predict interferon (IFN) treatment responses in patients with chronic hepatitis B. Methods Two hundred sixty-two patients with chronic hepatitis B (CHB) were treated with interferon alfa (IFN ) for 12 months. Six months later the therapeutic effectiveness was evaluated. All the patients had signed a formal consent form. The patients were grouped into a sustained response (SR) group and a non-sustained response (NSR) group according to their responses to the IFNα treatment. Single nucleotide polymorphisms of the antiviral protein MxA promoter -88,-123 and protein kinase(PKR) activated eIF-2α-reg2 sites were examined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and were compared with the responsiveness to IFN treatment of these CHB patients. Results Among the 262 patients, 212 (80.9%) were non-sustained responders to IFNα and 50 (19.1%) were sustained responders. The rate of sustained responders with GT heterozygote at MxA promoter -88 was higher than that of the GG genotype (OR: 5.3, 95% CI: 2.46-11.43, P < 0.01) and also higher than that of the TT genotype (OR: 4.1, 95% CI: 1.86-9.09, P < 0.01). There were no statistically significant differences in IFN therapeutic effectiveness among the patients with different genotypes at MxA promoter -123, eIF-2α-reg2 and haplotypes made by MxA promoter -88 G/T, and -123 C/A allales (P > 0.05). Conclusion Patients with GT genotype at MxA promoter -88 responded well to IFN treatment. SNP as a potential marker could be used to predict IFN treatment responses of patients with chronic hepatitis B.
【Key words】 Hepatitis B, chronic; Interferon; Myxovirus resistance A; Polymorphisms, single nucleotide; eIF-2
IFN是目前治疗CHB的有效药物之一，但患者应答效果差异很大，这既与HBV本身生物学特征及宿主对HBV的免疫状态等因素有关，也与宿主IFN遗传通道基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）有关。本研究选择了IFN诱导的抗病毒蛋白：蛋白激酶活化的真核细胞起始因子2α调节区2（eukaryocyte initiation factor 2 alfa regulatory region 2，eIF-2α-reg2）和粘病毒抵抗蛋白A（myxovirus resistance A，MxA）作为研究切入点，应用PCR及限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）的分析方法，检测患者MxA启动子-88，-123位点及eIF-2α-reg2的SNP，探讨其SNP与IFN疗效之间的关系，为个性化治疗提供参考依据。
资料与方法
1. 病例来源：2002年12月－2004年6月在北京佑安医院住院或门诊使用IFNα治疗的CHB患者262例，均签署知情同意书。入选标准：CHB诊断符合2000年《病毒性肝炎防治方案》中CHB诊断标准[1]，年龄16～60岁，汉族，HBV DNA阳性，HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性，ALT高于正常上限2倍以上，既往未用过IFN治疗。排除标准：非汉族，急性乙型肝炎，重型乙型肝炎，失代偿期肝硬化，合并其他肝炎病毒感染及具有重要脏器病变（严重心、肾疾患及精神病）等。
2. 治疗方案：IFNα 3～5MU/d，皮下注射，连续10d诱导治疗后隔日注射1次，疗程12个月。
3. 疗效评价[2]：持续应答（sustained response，SR）：疗程结束及停药6个月时，ALT正常，HBV DNA<1×103拷贝/ml，HBeAg阴性，抗-HBe阳性。非持续应答（non sustained response，NSR）：除持续应答外的情况。
4. 患者基因组DNA提取：采用常规的酚-氯仿法提取患者外周静脉血白细胞基因组DNA。
5．引物设计及主要试剂：通过美国国家生物信息中心的基因库（GenBank）获取elF-2α-reg 2和MxA启动子基因序列及相应位点的SNP信息，应用primer5.0并参考文献[3，4]设计符合研究要求的引物序列，引物由赛百盛生物工程有限公司合成，见表1（略）。TaqDNA酶、dNTP、DNA分子量标记购自北京鼎国生物工程有限公司。限制性核酸内切酶HhaⅠ、PstⅠ、SspⅠ均购自北京友谊中联公司代售的美国NEB公司产品。
6．PCR扩增目的基因：取上述不同患者的DNA提取液5μl，上下游引物各1.2μl（10pmol/L），10mmol/L dNTPs 2.4μl，25mmol/L氯化镁2.4μl，10×PCR缓冲液3μl，2U/μl Taq DNA酶1μl，补去离子水至总体积30μl。PCR扩增条件：elF-2α-reg2位点：94℃预变性5min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环，72℃延伸7min；MxA启动子-88：94℃预变性5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环，72℃延伸7min；MxA启动子-123：94℃预变性5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环，72℃延伸7min。取PCR产物8μl，20g/L的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下鉴定预期PCR产物片段大小。
7．RFLP方法检测SNP：3个多态性位点的相关情况见表2。PCR产物10μl，10×缓冲液2μl，限制性内切酶1μl（2U/μl），10×BSA 2μl，6×染料3μl，补去离子水构成总体积20μl反应体系。该反应体系在37℃酶切4 h。酶切产物20μl用20g/L的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下参照DNA 分子量标记鉴定酶切片段。
表2 （略） 8．质量控制：使用同一厂家同一批号的试剂，同一操作者在同一实验室进行检测，并对10%以上的标本进行复测。
9．统计分析：应用SPSS10.0统计软件，患者年龄采用t检验，结果以均数±标准差表示。基因多态性与IFN疗效的关系分析采用χ2检验。不同基因型CHB患者IFN应答效果两两比较进行相对危险性(risk)分析。统计学采用检验为双侧检验，界限水平定为0.05。
结 果
完成本研究全程治疗及随访患者为262例，其中男性188例，女性74例，年龄16～60（32.64±9.79）岁。262例患者中SR 50例（19.1%），NSR 212例（80.9%）。
1. 基因多态性分析：MxA启动子PCR产物经鉴定为599bp片段，与本研究引物设计预期的DNA扩增片段大小一致。分别用HhaⅠ（酶切MxA启动子-88位点G/T）、PstⅠ（酶切MxA启动子-123位点C/A）消化该PCR产物，电泳后结果见图1，2。elF-2α-reg 2 PCR产物经鉴定为563bp片段，与本研究引物设计预期的DNA扩增片段大小一致。用SspⅠ消化该PCR产物，电泳后结果见图3（略）。
2．基因多态性与IFN疗效的关系：MxA启动子-88位点各基因型之间干扰素应答率差异有统计学意义（表3略）。而各检测位点等位基因，MxA启动子-123、elF-2α-reg 2位点各基因型之间IFN应答率差异均无统计学意义（表4略）。
3．MxA启动子-88位点各基因型之间IFN应答效果及其相对危险性分析：MxA启动子-88位点GG型与GT型患者疗效比较（OR值5.30，95%置信区间2.46～11.43，χ2＝20.12，P＜0.01），TT型与GT型患者疗效比较（OR值4.11，95%置信区间1.86～9.09，χ2＝13.07，P＜0.01），差异均有统计学意义；GG型与TT型患者的疗效比较（OR值1.29，95%置信区间0.56～2.99，χ2＝0.35，P＞0.05），差异无统计学意义。
4. MxA启动子单体型与疗效的关系：由于单体型提供的遗传信息比单个核苷酸更丰富，因此单体型研究是探索基因与疾病关系的一个非常有效的方法，也越来越多的成为复杂疾病关联研究的有效工具。本研究对MxA启动子-88，-123做两个位点的单体型分析。MxA启动子-88(G/T)、-123(C/A)组成4种可能的单体型。单体型与CHB患者IFN治疗临床疗效的关系见表5，结果显示4种单体型干扰素疗效比较，差异无统计学意义。
表5 略 讨 论
人类基因组计划研究提示，人类基因的同源性为99.9%，仅0.1%的差异就决定了人们遗传性状的不同、对某些疾病易感性的不同以及对某些药物治疗反应效果的不同，而这些差异集中表现在“SNP”上。SNP有明显的种族差异，所以开展我国人群的SNP与乙型肝炎相关性的研究具有重要的意义。
本研究结果显示，262例CHB患者MxA启动子-88位点GG型115例，占总检测人数的43.9%；TT型85例，占32.4%；GT型62例，占23.7%。3组基因型患者之间IFN疗效比较：GT型患者出现SR的概率是GG型患者的5.3倍，是TT型患者的4.1倍，提示GT型的CHB患者对IFN治疗反应性好于GG和TT型患者，可能是IFN疗效的预测指标。TT型患者出现SR的概率是GG型患者的1.3倍，但差异无统计学意义。分析其机制可能如下：IFN与受体结合后，激活下游的Janus激酶-信号转导子和转录激活子（janus kinase-signal transducer and activator of transcription）信号通路形成两个转录因子：IFNα活化因子和IFN激活基因因子3。IFNα活化因子和IFN激活基因因子3转位入核，IFN激活基因因子3结合到含有IFN应答反应元件（IFN stimulated response element，ISRE）的抗病毒蛋白基因启动子上，引发一系列IFN诱导的抗病毒蛋白基因的表达。据GenBank显示，MxA启动子类似ISRE的序列有3处，MxA启动子-88位点所在区域（GGTTTCGTTTCTGCGC）与第2个ISRE序列相近，特别是G变成T后更类似ISRE序列（GGTTTCGTTTCTGCTC）。该类似ISRE序列也可促进MxA mRNA表达[5]，生成MxA抗病毒蛋白，进而MxA蛋白可与病毒核蛋白结合而损伤病毒衣壳蛋白起到抗病毒的作用，所以推测MxA启动子-88位点的SNP可能影响MxA基因的mRNA表达[6]。IFN治疗时，含T基因型（GT、TT）患者要比不含T基因型（GG）患者表达更多的MxA蛋白产物，因此GT、TT型患者抗病毒效果就会优于GG型患者。按照这一推理，TT型患者抗病毒效果应更好，但本研究TT型不如GT型的好，与上述推测有偏差，原因目前尚不清楚。
King等[3]报道82例中国台湾汉族CHB患者的细胞信号转导通路上相关因子的SNP与IFN疗效的关系时也提示MxA启动子-88位点GT型的CHB患者IFN治疗效果较好，研究还提示elF-2α-reg2的SNP与IFN疗效有相关关系，AG杂合基因型CHB患者IFN疗效差（P<0.01）。而本研究结果与此不同，未见elF-2α-reg 2的SNP与IFN疗效有相关性（P>0.05）。两个研究对象均为汉族人群，但结果不一致，其原因可能是：（1）样本含量不同：本研究样本量262例大于King等的82例，elF-2α-reg2基因型本研究中为AA、GG、AG型，King等只发现AA和AG型，没有GG型，可能与其样本例数少有关。（2）IFN治疗的应答标准不同：本研究持续应答的定义为停药6个月时，ALT正常，HBV DNA阴性（小于1×103拷贝/ml），HBeAg阴性，抗-HBe阳性；King等的应答标准为停药1年以上HBeAg阴性，没有提及病毒载量，其中不能排除HBV前C区变异情况，即HBeAg阴性同时可伴有HBV DNA阳性。所以两个研究的标准和统计材料均存在一定的差距，可能与结果有关。Hijikata等[5]，Suzuki等[7]和Knapp等[8]分别研究慢性丙型肝炎患者MxA启动子-88的SNP与IFN疗效的关系时得出的结论均与本研究结果一致。本研究显示，MxA启动子-123(C/A)位点SNP及MxA启动子-123，-88位点组成的单体型与IFN疗效均未见明显相关性。MxA启动子-88位为G，-123位为C的占37.6%； -88位为T，-123位为A的占17.0%。 Hijikata等[4]在研究慢性丙型肝炎时提示MxA启动子-123(C/A)位点SNP与干扰素疗效有关，CC纯合型CHB患者IFN应答效果差（P<0.01），并发现如果MxA启动子-88位等位基因为G，其-123位为C的占100%；-88位为T，-123位为A的占73%。两个SNPs高度连锁，并提示同一蛋白多个位点的SNP与IFN疗效有关，CG/AT杂和型患者的疗效好于CG/CG，AT/AT纯和型的。AT/AT纯和型的疗效理论推测应该最好，但实际结果是好于CG/CG型的但是次于CG/AT型的，这与其理论推测有偏差。Hijikata等[4]分析其原因有二：（1）样本量少；（2）与病毒基因型有关，AT/AT纯和型的患者感染病毒的基因型多为HCV-1b型。
本研究表明MxA启动子-88位点的SNP与CHB患者IFN疗效相关，MxA启动子-88位点为GT杂合基因型的CHB患者对IFN治疗反应好，可作为潜在的IFN疗效的预测指标。
参 考 文 献
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