【摘要】 目的 观察吡格列酮对TGFβ诱导的大鼠HSC形态和结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响，探讨吡格列酮抑制肝纤维化的机制。 方法 将大鼠HSC进行体外培养，并分为空白组、TGFβ组、TGFβ＋不同剂量吡格列酮组。观察HSC细胞发生的形态学改变，并用免疫组织化学、流式细胞仪定性及定量检测CTGF的表达；ELISA法测定培养细胞上清液中Ⅲ型胶原的含量。结果 TGFβ可以诱导大鼠HSC细胞形态发生改变和表达CTGF，且TGFβ组细胞上清液中Ⅲ型胶原含量增加（P<0.05）；吡格列酮组可以不同程度抑制TGFβ诱导的细胞形态学改变，各组CTGF的表达水平以及Ⅲ型胶原分泌均低于TGFβ组（P<0.05），且呈剂量依赖性（P<0.05）。 结论 吡格列酮能够抑制TGFβ诱导的大鼠HSC细胞形态改变、CTGF表达及Ⅲ型胶原的分泌，对肝纤维化具有抑制作用。
【关键词】 吡格列酮； 肝星状细胞； 转化生长因子β； 结缔组织生长因子； Ⅲ型胶原
Effects of pioglitazone on the morphology and the expression of connective tissue growth factor of transforming growth factor beta-induced rat hepatic stellate cells in vitro JIA Jin-bin*, LIU Yan, CHEN Wei-hua, LIU Mei, LU Lun-gen. *Department of Gastroenterology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200001, China
Corresponding author: LU Lun-gen,
【Abstract】 Objectives To observe the effects of pioglitazone on morphological changes and connective tissue growth factor (CTGF) expression of the transforming growth factor beta (TGF β)-induced rat hepatic stellate cells (HSCs) in vitro, and to investigate the anti-fibrotic mechanism of pioglitazone. Methods Cultured rat HSCs were divided into a no-treatment control group, a TGF β-treated group, and a TGF β plus different dosage pioglitazone-treated group. The morphological changes of the cultured HSCs were observed. The expression of CTGF was assessed by immunohistochemistry and flow cytometry. The level of collagen type III in the culture supernatant was measured by ELISA. Results TGF β induced morphological changes, and increased the expressions of CTGF and collagen type III of the HSCs (P < 0.05). Pioglitazone prevented the TGF β induced morphological changes of the HSCs. The expression of CTGF and the levels of collagen type III in the pioglitazone group were lower than the TGF β-treated group (P < 0.05). This prevention effect was dose-dependent (P < 0.05). Conclusion Pioglitazone blocks the excretion of CTGF and collagen type III of cultured HSCs, preventing the development of liver fibrosis.
【Key words】 Pioglitazone; Hepatic stellate cells; Transforming growth factor-beta; Connective tissue growth factor; Collagen type III
TGFβ是肝纤维化最重要的始动因子之一，研究表明TGFβ可以通过诱导其下游因子结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）的表达，促进细胞形态改变、增生、分化和细胞外基质的形成，在肝、肾等器官纤维化的发生发展中起着重要的作用[1-4]。HSC活化是肝纤维化发生的细胞学基础，被TGFβ激活的HSC可发生形态学改变和表达CTGF，表达的水平与肝纤维化程度呈正相关。本研究用TGFβ诱导体外培养的HSC，观察吡格列酮对TGFβ诱导的HSC形态改变，以及CTGF表达的影响，探索吡格列酮抗肝纤维化的作用机制，为临床肝纤维化的治疗提供依据。
材料与方法
一、材料
大鼠HSC-T6细胞株（上海坤肯生物化工有限公司），吡格列酮原料药（成都宇洋高科技发展有限责任公司），DMEM培养干粉（高糖型）（美国Gibco公司)，胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），胰蛋白酶、DMSO，N,N-羟乙基哌嗪乙烷磺酸（HEPES)（美国Sigma公司），辣根酶标记链霉卵白素工作液（SP）试剂盒（北京中山生物技术公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德公司），大鼠Ⅲ型胶原酶联试剂盒（北京天来生物医学科技有限公司）；羊抗大鼠CTGF多克隆抗体（加拿大Santa Cruz公司）,其他试剂均为国产分析纯品。
二、方法
1. HSC的培养：将复苏的HSC-T6细胞1×105/ml密度接种于50ml培养瓶，用含20%小牛血清（FCS）的DMEM培养液在37℃，5% CO2条件下传代培养。取第3～5代以1×109/ml接种于6孔板内用于试验。将细胞分为以下几组：（1）空白组（第1组）；（2）TGFβ 5ng/ml组（第2组）；（3）TGFβ 5ng/ml＋吡格列酮1μmol/L（第3组）、5μmol/L（第4组）、10μmol/L（第5组）、20μmol/L组（第6组）。每组设3复孔。
2. 细胞观察: 将细胞培养5d后，在相差显微镜下观察6孔板中的细胞形态；并进行固定、洗涤、脱水，用醋酸乙戊酯浸泡，干燥、装样并将样本喷镀包被。扫描电镜下观察细胞形态学。
3. 免疫组织化学: 将细胞培养5d后，收集上清液保存留作Ⅲ型胶原检测。经清洗、固定、0.3% H2O2溶液室温处理及封闭后，在待测区域细胞上顺序滴加羊抗大鼠CTGF多克隆抗体（1∶100）、生物素标记羊抗小鼠IgG工作液、SP复合物、DAB显色。待显色合适时，立即冲洗，中止显色，复染后浸洗、烘干，加拿大胶封片。在光镜下观察爬片和染色情况。
4. 流式细胞检测: 将细胞培养5d后，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，洗涤、离心，多聚甲醛于冰浴中固定，皂角素打孔，顺序加入CTGF多克隆抗体（1∶100），异硫氰酸罗丹明-羊抗鼠IgG（1∶50），洗涤后将细胞悬浮缓冲液中，用流式细胞仪测定104个细胞的CTGF表达，以CTGF平均荧光强度定量表示。
5. ELISA检测: 取出留存上清液，按试剂盒说明书在包被反应条加入稀释液、不同浓度标准品或待测标本，顺序加入孵育液、显色液、终止液，在酶标仪上测定Ⅲ型胶原的浓度值。
6. 统计学处理: 组间比较采用SPSS10.0统计分析软件行多组单因素方差分析（ANOVA），两两比较用LSD检验，CTGF与胶原Ⅲ的相关分析用Spearman法。所有数据均以均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. 细胞形态学变化：正常的肝星状细胞（HSC-T6）在6孔板中生长5d后，倒置相差显微镜下观察，细胞形态不规则成星状，偶有树状突起，富含脂滴，HE染色同样观察到上述表现。电镜扫描显示细胞树突较少。加入TGFβ培养5d后细胞活化，开始分裂、增殖，树突增多，细胞内脂质含量减少。电镜扫描显示细胞呈星状、树突样突起多，胞体呈椭圆形，表面有大量微绒毛。同时加入TGFβ和不同浓度的吡格列酮培养5d，可以不同程度地抑制TGFβ诱导的细胞形态的改变，在光镜下观察大多数细胞维持正常的HSC形态，仅存在少量发生改变的细胞。
2. CTGF的表达：（1）免疫组织化学染色结果: 空白对照组细胞在培养5d后保持正常HSC形态，仅少数发生增殖和活化，免疫组化染色可见少数细胞中存在棕黄色深染物质，说明CTGF表达较少（图1）。TGFβ组细胞培养5d，细胞发生活化、增殖，大量细胞CTGF表达阳性（图2）。TGFβ和不同浓度的吡格列酮培养细胞，形态介于空白组和TGFβ组之间，细胞增殖数目较TGFβ诱导组少，着色较浅，且阳性表达的细胞数少于诱导组，不同剂量组的形态变化由于浓度不同而各异（图3）。（2）流式细胞术检测结果：空白对照组细胞CTGF表达很少，经TGFβ诱导后细胞CTGF表达的平均荧光强度（MCF）明显增加，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。同时加入TGFβ及不同剂量吡格列酮培养的细胞，其MCF均比TGFβ诱导组明显下降（P<0.05），除TGFβ5ng/ml+20μmol/L吡格列酮组外（P>0.05），其余各组MCF均较空白对照组升高（P<0.05），且随着吡格列酮剂量的增加这种下降趋势逐步增加，呈剂量依赖（bMCF＝-10.887，P<0.05）。见表1（略）。
3. Ⅲ型胶原的表达：TGFβ组细胞培养上清液中Ⅲ型胶原含量明显增加，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。同时加入TGFβ及不同剂量吡格列酮培养的细胞，Ⅲ型胶原分泌量均不同程度减少，与TGFβ诱导组相比差异有统计学意义（P<0.05），但除TGFβ5ng/ml+20μmol/L吡格列酮组外（P>0.05）均高于空白对照组（P< 0.05）。且随着吡格列酮剂量增加上清液中Ⅲ型胶原的含量减少，有剂量依赖关系（b胶原＝-41.780, P<0.05）。
4. CTGF与Ⅲ型胶原表达的相关性分析：对各组细胞CTGF的表达与Ⅲ型胶原的分泌进行相关性分析，发现CTGF与细胞培养上清液中Ⅲ型胶原含量有正相关关系（r＝0.969, P<0.01）。
讨 论
HSC活化和增殖是肝纤维化发生的中心环节[5]。研究发现，在急、慢性肝损伤后，HSC在致病因子刺激下被激活、分化和大量增殖，产生各种细胞因子如TGF、IL-6、TNFα等，合成大量细胞外基质，同时产生基质金属蛋白酶，引起组织间质增生[6，7]，是肝纤维化发生发展的主要参与者。HSC近来已成为研究肝损伤后纤维化形成的中心环节。TGFβ是一类能够调节细胞生长和分化的多肽，具备多种生物学作用。多个研究结果表明，在肝纤维化发生、发展过程中具有活化HSC，促进胶原基因表达，促进细胞外基质合成与沉积等作用，是最重要的促肝纤维化细胞因子之一[7, 8]。
随着HSC活化及增殖调控研究的深入，CTGF的表达在细胞外基质及纤维化领域的研究引起关注。CTGF是一个由349个氨基酸组成的分子量为36×103～38×103的多肽链，含有38个半胱氨酸，属于CCN（Connective tissue growth factor, Cysteine-rich 61, Nephroblastoma overexpressed）生长因子家族。已有研究证实，在CTGF的启动子上有TGFβ的反应元件，这是它与其他的CCN家族成员不同之处，TGFβ是最强的CTGF表达诱导剂[9]。我们的试验发现，TGFβ诱导的HSC中，可以见到明显的增殖和活化现象，以及CTGF表达显著增强，这与其他的研究结果一致[10]。我们进行相关分析发现CTGF的表达量与细胞分泌的Ⅲ型胶原的含量有正相关关系。提示CTGF可能直接介导了TGFβ在肾小管上皮细胞的致纤维化作用。
吡格列酮是新一代二型糖尿病治疗药，分子式为：C19H20N2O3S.HCl。越来越多的研究发现吡格列酮不仅具有胰岛素增敏效应，尚存在许多其他的有益作用，如能防治脂肪肝及相关肝纤维化的进展，具有临床应用潜能[11,12]。本研究中用TGFβ作为刺激因素，观察噻唑烷二酮类药物吡格列酮可否阻断TGFβ诱导HSC活化以及表达CTGF的作用。我们观察到，吡格列酮明显抑制了TGFβ诱导的CTGF表达，吡格列酮组表达CTGF的阳性细胞减少，细胞CTGF mRNA表达水平也明显下降，且有剂量依赖关系。试验用ELISA法检测上清液中Ⅲ型胶原含量，发现各剂量的吡格列酮均能不同程度地抑制TGFβ诱导的Ⅲ型胶原分泌。相关分析提示CTGF的表达与Ⅲ型胶原分泌具有正相关关系。同样地Galli等[13]在体内和体外的研究也证实了噻唑烷二酮类药物可抑制HSC的活化和胶原的产生，而显示有较好的抗肝纤维化作用。我们的研究也进一步证实了噻唑烷二酮类药物吡格列酮可通过抑制CTGF的表达而阻断了TGFβ诱导的HSC活化和细胞外基质的生成，这可能是吡格列酮防止肝纤维化发生发展的机制之一。
参 考 文 献
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