【摘要】 目的 探讨1.5 T MRI活体示踪磁标记干细胞经门静脉肝脏移植的可行性。 方法 大鼠间充质干细胞以菲立磁和DAPI标记后，经门静脉注入大鼠肝脏，分别于移植前及移植后1h、3d、7d和14d行MRI扫描，并与组织荧光显像和铁染色对照。 结果 移植后1h、3d、7d及14d肝脏信噪比分别为1.10±0.26、8.18±1.55、11.08±1.30、14.15±1.02，7d以内肝脏信噪比与移植前比较均有明显降低（P<0.05）。各时相肝组织铁染色与荧光显像的空间分布一致。 结论 1.5 T MRI活体示踪经门静脉移植的磁标记干细胞是可行的，MRI示踪时间可持续7d。
【关键词】 大鼠； 干细胞，间充质； 磁共振成像； 超顺磁性氧化铁
Tracing magnetically labeled mesenchymal stem cells transplanted into rat livers by MRI CAI Jin-hua*, FENG Gan-sheng, WANG Xin, LIU Guan-xin, ZHANG De-ying, HU Lin-yan. *Department of Radiology, Children’sHospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China
【Abstract】 Objective To trace magnetically labeled MSCs transplanted into the rat livers by magnetic resonance imaging (MRI). Methods Feridex and DAPI labeled rat mesenchymal stem cells (MSCs) were injected via portal veins into carbon tetrachloride treated rats. MRI was performed with a clinical 1.5 T MRI machine immediately before the MSCs injection and at h 1, d 3, d 7, and d 14 after the injection, and then the signal-to-noise ratio (SNR) was measured. MRI findings were compared with the liver histopathologies after the slides were stained with fluorescence dye and Prussian blue. Results The SNR for liver was 1.10±0.26 at hour 1, 8.18±1.55 at day 3, 11.08±1.30 at day 7, and 14.15±1.02 at day 14 respectively. Within 7 days after the MSCs transplantation, the SNRs of the livers were significantly lower than those before the transplantation (P < 0.05). Histologically, the blue fluorescent particles under the fluorescence microscopy matched in distribution with the iron particles on the Prussian blue stained slides. Conclusion The magnetically labeled MSCs transplanted into livers give rise to an obvious signal decrease, and can be tracked with a 1.5 T clinical MRI machine for up to 7 days after MSCs transplantation.
【Key words】 Rat; Mesenchymal stem cells; Magnetic resonance imaging; Superparamagnetic iron oxides
通过干细胞示踪可了解移植后干细胞在受体内的存活及分布等状况，这对评估干细胞移植效果和优化干细胞治疗方案具有重要意义。传统的示踪方法多采用基因、染色体、荧光染料等进行细胞标记，在离体状态下通过组织标本的病理学分析来显示干细胞移植情况[1-3]，这不适应干细胞移植临床应用的需要，因此有必要建立一种无创伤、有效的活体示踪技术。我们采用超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxides, SPIO）纳米微粒标记大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs），将磁标记干细胞经门静脉移植入大鼠肝内，行动态MRI及相关病理检测，探讨MRI活体示踪磁标记干细胞经门静脉移植的可行性。
材料与方法
1 实验材料：（1）实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠40只，由重庆医科大学实验动物中心提供。6周龄10只，用于干细胞分离；3月龄30只，用于干细胞移植。（2）主要仪器：倒置相差显微镜（OlympusIX70，日本）、CO2培养箱(SL，美国)、荧光显微镜及摄像系统（OlympusBX51，日本）、MRI系统（1.5 T Siemens sonata，德国）、冰冻切片机（Thermoshandon，日本）、骨髓彩色分析系统（重庆天海公司产品）。（3）主要试剂：杜氏改良F-12培养基（Dulbecco’s modified eagle medium/F12, DMEM/F-12，美国Hyclon公司产品）、胎牛血清（美国Hyclon公司产品）、胰蛋白酶（上海生工生物工程公司产品）、菲立磁（美国先进磁力公司产品）、联咪二苯蚓哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI，德国Roche公司产品）。
2. 实验方法：（1）MSCs的分离、培养：参照文献[4]方法进行。（2）MSCs标记：第4代大鼠MSCs行菲立磁和DAPI双标记。菲立磁标记：多聚左旋赖氨酸修饰后，以25μg/ml浓度标记[4]；DAPI标记：将50μg/ml的DAPI 0.5ml加入含MSCs，孵育过夜。（3）大鼠急性肝损伤模型的建立及分组：30只Wistar大鼠，2% CCl4按2.5ml/kg灌喂，每日1次，首次剂量5ml/kg，连续3d。动物随机分为实验组20只和对照组10只。（4）细胞移植：10%乌拉坦按10ml/kg腹腔注射麻醉，麻醉满意后剖腹并游离出门静脉，用1ml注射器将悬于0.5ml培养基的1×106个标记干细胞注入门静脉。对照组以同样方法注入等量未标记干细胞。（5）MRI：分别于细胞移植前及移植后1h、3d、7d和14d取4只实验组和2只对照组大鼠行MRI扫描及信号分析。MRI扫描采用GRE T2*WI成像（TR/TE：300/20ms，15°），表面线圈，层厚3 mm，矩阵256×160，2～4次采集，视野6～8cm×6～8cm。测量靶器官（肝脏、肾脏与背部肌肉）信号及背景噪声，计算信噪比（signal to noise ratio，SNR）。（6）标本处理及病理检测：动物于MRI扫描后立即处死，取肝组织行HE染色观察肝损伤情况，同时取肝、肾、肺、脾和肌肉等组织，冰冻切片，行荧光显微镜观察和普鲁士蓝染色。（7）统计学分析：所有数据以x-±s表示，应用SPSS10.0软件，移植前及移植后各时间点SNR比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. MRI信号变化：实验组与移植前（图1A）比较，移植后1h肝脏信号明显降低（图1B），之后信号降低程度逐渐减弱（图1C、1D、1E）。对照组细胞移植后肝脏信号无明显变化（图1F）。方差分析显示，实验组移植前及移植后各时相肝脏SNR差异有统计学意义（F＝111.88, P<0.05）。组内多重比较显示，实验组移植后1h、3d、7d的肝脏SNR与移植前比较差异有统计学意义(t值分别为13.50、6.43、3.53，P值均<0.05)，而14 d时SNR与移植前差异无统计学意义（t＝0.45，P>0.05），见表1。
2. 病理结果：（1）HE 染色结果：肝组织出现明显损害，主要表现为小叶中央肝细胞肿胀，部分肝细胞胞质深染，并可见点状坏死。（2）荧光显微镜观察结果：移植后1h，实验组肝内见较多蓝色荧光颗粒（图2A），之后逐渐减少（图2B、2C、2D）。肺、肾、脾、肌肉及腹膜均未见荧光颗粒。（3）普鲁士蓝染色结果：移植后1h，实验组肝组织内见较多蓝染铁颗粒，多沿血窦分布（图3A）；之后铁颗粒渐少（图3B、3C、3D）。高倍镜下观察，铁颗粒始终位于细胞内，细胞形态完整（图4A、4B）。各时相肝组织铁染色与荧光颗粒分布区域高度一致。肺、肾、脾、肌肉及腹膜均未见明显铁染色。
讨 论
以往干细胞的MRI示踪研究多采用局部点注射将磁标记细胞移植入实体组织，使干细胞得以在组织局部形成较高的浓度，因而MRI信号改变明显，示踪时间也相对较长[5，6]。然而，在干细胞移植的实际应用中，点注射移植方式只能用于某些局部病变的治疗，对于弥漫性或系统性病变，干细胞治疗以血管注射方式移植似乎更为合理。经血管注射移植后，磁标记干细胞在组织器官内呈弥散分布，且有随血流迁移至靶器官以外的可能，在这种情况下，如何提高干细胞在靶器官的浓度，延长干细胞在靶器官内驻留的时间是MRI活体示踪首要解决的问题。
本实验在设计时从两个方面尽量提高干细胞在肝脏的定居率，即通过建立大鼠急性肝损伤模型以提供干细胞在肝脏生长的微环境，经门静脉注射以提高局部细胞浓度。尽管在磁标记干细胞移植后发现了明显的信号改变，但随着时间的延续，信号降低的程度逐渐减弱，在第14天时信号改变已不明显。这一MRI信号变化的趋势在理论上可用以下几种原因解释：其一，细胞内铁随细胞增殖而分散传入子代细胞；其二，移植细胞随血流迁移至肝外；其三，细胞内铁随细胞死亡而降解。虽然MSCs在体内扩增的周期尚不可知，但根据我们体外培养经验，在短短的2周内细胞内铁不可能因传代而完全消失。如果细胞仍然驻留在肝脏，即使发生了细胞扩增，铁的总量也不会发生太大变化，不至于影响MRI信号的变化。而且，我们在14d所发现的少量移植细胞中仍含有较多的铁颗粒，也提示细胞因增殖而使铁含量减少的可能性不大。另外，如果细胞随血流迁徙至肝外其他组织，那么肺脏应该是首先经过的部位，然而实验中并未发现肺内有任何铁染色及荧光显像的迹象，因此，干细胞随血流迁至它处的可能性也不大。排除了上述两种可能，我们认为第三种可能性最大，即大部分干细胞随移植时间延长而逐渐死亡，其内标记物迅速降解，从而导致了MRI信号的消失。至于细胞死亡的原因，可能与肝内缺乏干细胞存活及定居的微环境有关。通过建立合适的动物模型，提供适于干细胞生存的微环境，是解决这一问题的关键。目前对肝脏干细胞移植的研究多采用肝纤维化后三分之二肝切除模型，这一模型同时具备肝组织受损和肝再生需求两种因素，有利于干细胞的活化和增殖，但模型制作技术有一定难度。本实验所采用的急性肝损伤模型，虽然在一定程度上较正常肝脏更有利于吸引干细胞聚集，但并未真正提供干细胞在肝脏定居以及增殖、分化的微环境。
Bos等[7]将5×106个磁标记MSCs通过门静脉注入损伤大鼠肝脏，虽然发现肝脏信号降低可持续12d，但同样由于移植细胞数目的减少而无法进行长时间的MRI示踪。我们所观察到信号改变的时限相对较短，主要原因可能是移植细胞数量较少，细胞在肝脏选择定居的比率相应减少。通过增加移植细胞数量可能会提高干细胞在肝脏的定居率。当然，除动物模型和移植细胞数量外，可能还有其他更多或更重要的因素决定干细胞在肝脏的定居率，从而影响MRI示踪时限。
磁标记细胞肝脏移植后MRI信号改变是否由移植细胞内的铁引起？有无细胞（或死亡后铁颗粒溢出）被巨噬细胞吞噬而引起MRI信号降低的可能？本实验采用干细胞双标记法，即同时进行磁标记和荧光染料标记。研究结果显示，在相邻切面的组织切片中，铁染色与荧光显像具有一致性，这说明铁颗粒仍然存在于细胞内，铁染色高倍镜下观察也证实了铁颗粒确是位于圆形干细胞内。本研究中未发现明显巨嗜细胞吞噬铁颗粒的现象，可能与铁的用量较少有关，菲立磁用于细胞标记的量与临床上作为靶向造影剂的用量相比微乎其微，即使细胞死亡，逸出的铁颗粒也会很快进入血循环并参与体内铁的再利用，不至于被巨噬细胞吞噬而引起MRI信号改变。
参 考 文 献
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