【关键词】 肝炎病毒，乙型； 免疫电镜； 转基因小鼠
Detection of HBV particles in the serum of transgenic mice by immmunoelectron microscopy HU Lian-mei, LI Xiu-mei, HUANG Li-zhen, LIU Guang-ze.
【Key words】 Hepatitis B virus; Immunoelectron microscopy; Transgenic mouse
【First author’s address】 Key Laboratory of Hepatopathy, PLA 458 Hospital, Guangzhou 510602, China
Corresponding author: LIU Guang-ze, Email: lgze@tom.com
HBV感染具有种属特异性，只感染人及黑猩猩等灵长类动物，因而使乙型肝炎的研究缺乏理想的实验动物模型。随着转基因技术的发展，国内外一些学者已建立了各种类型的HBV转基因小鼠模型，为乙型肝炎的研究提供了实验模型。刘光泽等[1]应用受精卵显微注射成功建立了HBV转基因小鼠，并应用血清学、免疫学及分子生物学等技术检测到HBV DNA的表达[2，3]。我们应用免疫电镜技术检测转基因小鼠中HBV病毒的形态及数量，更直观的证实这一转基因小鼠模型。
一、材料与方法
1. 材料：（1）动物：HBV（ayw）转基因小鼠(解放军第四五八医院肝病重点实验室建立)。(2)抗体：抗-HBs单克隆抗体，购于武汉博士德公司。（3）抗-HBs ELISA诊断试剂盒，购于上海华美生物工程公司。（4）HBV PCR荧光定量检测试剂盒，购于深圳匹基公司。
2. 方法：（1）血清ELISA酶联检测：取血清按ELISA检测试剂盒操作步骤进行检测，用自动酶标仪测其D值，并按试剂盒说明书进行结果判断。（2）血清HBV DNA拷贝数的测定：取血清按HBV PCR荧光定量检测试剂盒测定，并按说明书分析判断结果。（3）HBV病毒的免疫电镜制片：超速离心：采用不连续蔗糖密度梯度离心，在离心管内依次加入60%、50%、40%、30%、20%、10%的蔗糖各1.5ml，然后于上部加入样品血清0.8ml，34000r/min，4℃，离心16h。透析：取样品底部溶液约2ml，置于预先用Tris?HCl (pH7.2)浸泡过的透析袋中，放入Tris?HCl (pH7.2)透析液中，过夜透析。然后4℃，15000r/min离心30min，弃上清液，沉淀用Tris?HCl (pH7.2)溶解，形成混悬液。抗原-抗体凝集反应：混悬液和等量的抗体溶液，混合孵育，4℃，过夜后，15000r/min，30min，离心取沉淀。复染：1%磷钨酸溶液染色。日立H-7500透射电镜观察。
二、结果
1．HBV转基因鼠血清HBsAg表达：应用ELISA方法检测个体血清HBsAg滴度持续稳定性，结果显示本转基因鼠模型随月龄变化其表达水平是稳定、持续的。见图1。
2．HBV病毒颗粒在血清中的复制：对221只转基因小鼠血清HBV DNA进行荧光定量PCR检测，HBV DNA水平为104～106拷贝/ml，阳性率为93.67%（HBV DNA水平＞103拷贝/ml）且长期保持较高阳性率，性别差异无统计学意义。
3. 免疫电镜下HBV病毒颗粒的形态观察：在透射电镜下，可以看到小球型的HBsAg，直径在22nm左右；发现少量的Dane氏病毒颗粒，直径在42nm左右。见图2。
三、讨论
由HBV转基因鼠血清HBsAg表达，及荧光定量PCR测定HBV病毒颗粒在血清中的复制的结果，可以看出本HBV转基因小鼠模型可长期稳定高表达复制HBV DNA，这为此转基因模型应用于抗乙型肝炎药物评价奠定了良好基础。
小球形HBsAg为病毒复制后的剩余部分，具有抗原性。大球形颗粒为Dane氏病毒是完整的HBV，它的存在意味着体内病毒的复制活跃。
在透射下观察到HBV（ayw）转基因小鼠血清中存在HBsAg颗粒和Dane氏颗粒。此结果证实了该转基因小鼠模型的后代能继续复制、组装并分泌HBV病毒颗粒。在形态学上进一步证实了这是一成功的HBV模型，用于研究乙型肝炎免疫耐受等发病机制药物筛选和疫苗验证等颇具实用价值。
参 考 文 献
[1]Liu GZ, Xiong YL, Wang HM, et al. Establishment of high level expression HBV transgenic BALB/c mice and its genetic and expressive stability. Zhongguo Shouyi Xuebao, 2003, 23: 580-582.
刘光泽,熊一力,王洪敏,等.近交系高表达HBV转基因小鼠的建立及表达传代稳定性. 中国兽医学报,2003,23:580-582.
[2]Liu GZ, Xiong YL, Liu HP, et al. The analysis of TLR2 and TLR9 of DC and T cell from spleen in HBV transgenic mice. Zhongguo Mianyixue Zazhi, 2005, 21: 367-368.
刘光泽,熊一力,刘慧萍,等.HBV转基因小鼠脾脏DC的TLR2、TLR9和T细胞Elispot检测分析.中国免疫学杂志,2005,21:367-368.
[3]Liu HP, Xiong YL, Shi L, et al. Study on cellular immune response to large-dose HBsAg vaccine in transgenic mice. Jiefangjun Yixue Zazhi, 2005, 30: 66-67.
刘惠萍,熊一力,施理,等.大剂量HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠细胞免疫调节的研究.解放军医学杂志,2005,30:66-67.
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