【摘要】 目的 研究NAFLD大鼠肝X受体α（LXRα）基因表达变化及意义。 方法 建立高脂饮食诱导NAFLD大鼠模型后，采用RT-RCR和Western blot法动态观察NAFLD大鼠肝组织中LXRα表达变化。结果 4周时模型组大鼠血清游离脂肪酸含量达（0.33±0.03）mmol/L，对照组为（0.24±0.03）mmol/L，差异有统计学意义（P<0.05），随喂养时间延长逐渐升高，12周时模型组大鼠血清游离脂肪酸含量达（0.61±0.06）mmol/L，对照组为（0.25±0.01）mmol/L，差异有统计学意义（P<0.01）。血清ALT和AST含量在8周时模型组分别为75.8U/L和138.9U/L，对照组分别为54.8U/L和81.4U/L，差异有统计学意义（P<0.01)，12周时模型组分别为102.3U/L和179.1U/L，对照组分别为54.3U/L和79.2U/L，差异有统计学意义（P<0.01)。2周时模型组大鼠肝组织中LXRα基因表达相对含量为0.62，对照组为0.33，差异有统计学意义（P<0.01），随着高脂饮食喂养时间的延长表达进一步增强，12周时模型组大鼠高达1.31，对照组为0.34，差异有统计学意义（P<0.01）。模型组大鼠肝组织中LXRα蛋白表达与基因表达趋势相同，与脂肪肝进展程度一致。结论 LXRα基因表达变化与NAFLD的形成密切相关。 The significance and effects of liver X receptor alpha in nonalcoholic fatty liver disease in rats AI Zheng-lin, CHEN Dong-feng. Department of Gastroenterology, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China【关键词】 脂肪肝； 大鼠; 肝X受体α； 脂代谢紊乱 Corresponding author: CHEN Dong-feng, Email: dfchen9@hotmail.com 【Abstract】 Objective To explore liver X receptor alpha (LXR alpha) gene changes and their significance in nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rats. Methods A rat model of nonalcoholic fatty liver disease was produced with a fatty diet regime (feeding group, FG). Rats fed with normal diet served as controls (CG). The mRNA and protein expressions of LXR alpha in liver tissues were detected by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot. Result The concentration of free fatty acid (FFA) in the sera of GF rats started to increase to 0.33 mmol/L after 4 weeks of fat diet feeding, while the FFA of the CG was just 0.24±0.03 mmol/L, and the difference was significant (P < 0.05). The concentration of ALT and AST in sera of the FG rats started to increase to 75.8 U/L and 138.9 U/L at the 8th week, much higher than those of the CG (P < 0.01), and at the 12th week they increased further (P < 0.01). Meanwhile, the mRNA and protein expressions of LXR alpha at the 2nd week was significantly increased to 0.62 (P > 0.01) and its peak was reached at the 12th week (P < 0.01). There was a significant positive correlation between the expression of LXR alpha and the degree of NAFLD. Conclusion The changes of LXR alpha gene are closely related to the development of nonalcoholic fatty liver disease. 【Key words】 Fatty Liver; Rats; Liver X receptor alpha; Lipid metabolism disorder 目前认为NAFLD与脂质代谢异常、胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）、氧应激及脂质过氧化反应等因素密切相关。既往研究表明脂肪酸代谢紊乱是NAFLD发生发展的基础和关键环节之一。如果在脂肪酸的摄取、氧化、合成、酯化和TG的转运中出现一个或多个环节异常，就有可能诱发TG在肝内异常沉积而形成脂肪肝[1, 2]。最新研究表明肝X受体α(liver X receptor α, LXRα) 属孤核受体家族，在脂代谢密切相关的组织中大量表达，以肝脏中含量最多。LXRα作为一种氧化固醇激活的核受体参与机体多种生理活动的调节，尤其在脂肪酸合成中具有重要作用[3, 4]。本研究采用RT-PCR与Western blot动态观察LXRα在高脂饮食诱导NAFLD大鼠模型中的基因和蛋白表达，探讨LXRα与NAFLD的关系。 材料与方法 1. 动物分组及模型建立：4周龄Wistar雄性大鼠48只，平均体重（198.0±7.3）g,由第三军医大学实验动物中心提供。适应性饲养1周后，随机分为对照组（C组）：给予基础饲料；NAFLD组（F组）：给予高脂饲料，由基础饲料88%，猪油10%，胆固醇2%组成，每组又分为2、4、8、l2周4个时相点，各时相点随机分配6只动物。 2. 肝组织病理学：留取约1cm×1cm×1cm 大小肝组织，石蜡切片，常规HE染色，观察脂肪变程度。病理诊断标准参照2006年2月《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》中的诊断标准[5]。 3 . 血清游离脂肪酸（FFA）、ALT、AST测定：分别于2、4、8、l2周处死动物，心脏采血5ml，4000r/min离心10min，吸取血清，采用全自动生化分析仪测定FFA、ALT、AST含量。 4. RNA抽提和RT-PCR：肝组织总RNA提取和cDNA合成分别采用Trizol试剂盒（博大泰克公司），和TaKaRa PT-PCR试剂盒（大连宝生物公司），按标准步骤操作。引物序列：LXRα上游：5′-ACG，AGCTATGCAGTGTATGTGGG-3′；下游：5′-CCTCTTCTTGATGCTTCAGTTTC-3′，扩增片段长度270bp。β-actin上游：5′-CTGAGAGGG AAATCGTGCGT-3′；下游：5′-CGGACTCAT CGTACTCCTGCTTG-3′，扩增片段长度486bp。PCR扩增：94℃预变性2min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，进行30个循环，最后72℃再延伸5min。经20g/L琼脂糖凝胶电泳，利用ImageMaster VDS-CL凝胶分析系统对扩增产物条带进行扫描，以LXRα/β-actin的吸光度比值作为LXRα mRNA表达的相对含量。 5. Western blot检测LXRα蛋白表达：右叶肝组织200mg加入RIPA裂解液2ml中，冰浴下匀浆15～20次，至匀浆液均匀无颗粒。将裂解液吸入1.5ml EP管中（0.5ml/管），置冰上裂解60min。4℃离心，26000×g，15min。取上清液，重复离心1次(4℃，26000×g，15min)。Folin法定量后,取50μｇ蛋白，变性，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉室温封闭1ｈ，山羊抗鼠LXRα抗体1∶500（美国Santa Cruz公司）浸泡滤膜，4℃过夜，洗涤后加入辣根过氧化酶结合的抗山羊IgG 1∶5000 (北京中杉公司)，洗膜后化学发光试剂检测，Ｘ光片显影。定量分析采用分子生物学图像分析系统测定各目的条带积分灰度值，所测结果为扣除背景的积分光密度。 6. 统计学处理：数据分析采用SPSS10.0软件，计量资料以x-±s表示，进行单因素方差分析。 结 果 1. 肝组织病理结果：光镜观察发现C组大鼠肝小叶结构规则，细胞形态正常。F组大鼠高脂饲养2周后，有少许肝细胞胞质疏松，并可见小泡样脂滴，脂肪变肝细胞数<5%，为0度脂肪肝。F组4周时呈2度脂肪肝，肝细胞浊肿，部分胞质疏松呈空泡状，有较多的小泡性脂滴沉积，脂肪变肝细胞数30%～50%。F组8周时呈3度脂肪肝，大多数肝细胞内充满脂滴，以大小泡混合型为主，脂肪变肝细胞数50%～75%。F组12周时广泛弥漫性肝细胞变性，胞质内充满大量脂肪空泡，脂肪变肝细胞数>75%，呈4度脂肪变；同时部分视野下肝细胞呈点灶状坏死，肝小叶及汇管区有炎细胞浸润，呈轻至中度炎症，为脂肪性肝炎G2期。 2. 血清FFA、ALT、AST含量变化：2周时，F组血清FFA含量与C组相比, 差异有统计学意义；随喂养时间延长， 4周时F组血中FFA含量开始增高，12周时最明显，与C组相比，差异有统计学意义，P<0.01，见表1。F组2周、4周时血中ALT、AST含量，差异无统计学意义。8周、12周时，ALT、AST含量明显高于C组，差异有统计学意义，P<0.01，见表2。 3. RT-PCR检测大鼠肝组织LXRα mRNA表达变化：各组各时相点均有LXRα mRNA的阳性扩增条带，LXRα片段扩增长度为270bp。F组从2周开始，大鼠肝组织LXRα基因mRNA转录增多，随脂肪肝程度的加重逐渐增加，4周、8周转录水平进一步增强，12周时增高幅度最明显，与C组相比，差异有统计学意义，P<0.01，见图1，表3。 表3 非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织肝X受体α mRNA表达 (x-±s, n＝6) 分组 2周 4周 8周 12周 对照组 0.33±0.04 0.33±0.03 0.33±0.03 0.34±0.02 NAFLD组 0.62±0.03a 0.85±0.02a 1.01±0.03a 1.31±0.02a F值 0.29 0.51 0.67 0.98 注：a 与对照组比较，P<0.01 4. 大鼠肝组织LXRα的蛋白表达变化：各组各时相点均有LXRα蛋白的阳性扩增条带，蛋白分子量为50×103。F组从2周开始，肝组织LXRα 蛋白含量增加，随脂肪肝程度的加重逐渐增多，4周、8周表达水平进一步增强，12周时最明显，见图2。 讨 论 目前对NAFLD发病机制的研究已取得了一些进展，但其远未完全阐明，其中脂质代谢异常被认为是最基础的环节之一。当高脂饮食、高脂血症和外周脂肪组织动员增加，使FFA进入肝细胞增多，β氧化减少，而合成TG增强，TG转运出肝细胞障碍，在肝细胞内异常沉积，引起肝细胞脂肪变性。 LXRα是一类与脂质代谢有关的核激素受体蛋白，调节几类重要的脂类物质代谢。LXRα被内源性配体氧化固醇或人工合成配体激活后,与类视黄醇X受体结合形成异二聚体，后者通过与靶基因中称为LXR 反应元件的特定核苷酸序列结合促进许多靶基因，包括固醇调节元件结合蛋白-1c、脂肪酸合成酶等成脂基因的表达，从而调控和维持脂肪酸代谢平衡[6]。 本研究采用RT-PCR和Western blot检测LXRα mRNA及其蛋白表达，发现LXRα的基因表达及其蛋白水平从2周开始增高（P<0.01），但肝组织HE染色并未见明显脂肪变，且血清FFA也未见异常（P>0.05），提示机体可能存在一个自我适应和调节的能力，使脂肪酸的分解、合成处于动态平衡，以维持机体脂质代谢的稳定。随着高脂喂养时间的延长，二者的表达不断增强，肝脂肪变的程度也逐渐加重，在4、8、12周分别出现2度、3度、4度脂肪肝。同时检测血清FFA含量，发现从4周时开始升高，随着LXRα表达增强，在12周时升高非常显著。提示可能由于高脂饮食的诱导，血中FFA升高，其代谢产物氧化固醇增多，而后者正是LXRα的内源性激动剂，LXRα被激活后与RXR形成异二聚体，启动下游靶基因——脂肪酸合成基因的转录。随着LXRα的过度表达，使脂肪酸合成异常增多，引起肝细胞脂肪变性，NAFLD的发生。 本研究对血清ALT、AST含量检测发现F组2周、4周时二者无明显升高，在高脂饮食喂养8周后，随着血清FFA的增多，血中ALT、AST开始升高(P<0.01)，而病理上肝小叶未见明显炎细胞浸润及肝细胞坏死，推测机体此时可能正处于单纯性脂肪肝向NASH过渡的阶段。此阶段虽有肝细胞轻度损害，但肝细胞内存在多种抗氧化物质如过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、NADPH、超氧化物歧化酶等，可以对抗氧应激、脂质过氧化等损伤，延缓炎性细胞及炎症介质释放，从而保持肝细胞功能的完善。随着时间的延长，12周时F组血ALT、AST明显异常，肝组织病理见肝细胞NASH G2期改变。推测LXRα表达增强可通过激活下游脂肪酸合成基因的转录，引起血中FFA升高。而FFA是具有高度细胞毒性的两性分子，FFA可通过加强脂质过氧化损伤、与细胞因子网络和核转录因子间的相互作用、细胞色素P4502E1(CYP2E1)表达增高等诱发NASH[7, 8]。 在NAFLD形成过程中LXRα表达明显增加，与脂肪酸代谢紊乱、脂肪肝程度密切相关，对于深入认识NAFLD的发病机制具有非常重要的意义。 参 考 文 献 [1]Caldwell SH, Crespo DM. The spectrum expanded: cryptogenic cirrhosis and the natural history of non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol, 2004, 40: 578-584. [2]Feng AJ, Chen DF. The expression and the significance of L-FABP and FATP4 in the development of nonalcoholic fatty liver disease in rats. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 776-779. 冯爱娟,陈东风.肝细胞L-FABP、FATP4在大鼠非酒精性脂肪性肝病形成中的表达及意义.中华肝脏病杂志,2005,13:776-779. [3]Lund EG, Peterson LB, Adams AD, et al. Different roles of liver X receptor alpha and beta in lipid metabolism: effects of an alpha-selective and a dual agonist in mice deficient in each subtype. Biochem pharmacol, 2006, 71: 453-463. [4]Ai ZL, Chen DF, Wang XM. The studies on liver X receptor. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2005, 13: 2013-2015. 艾正琳,陈东风,王晓敏.肝X受体研究进展.世界华人消化杂志,2005,13:2013-2015. [5]Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease Study Group of the Chinese Liver Disease Association. Guidelines for diagnosis and treatment of nonalcoholic fatty liver diseases. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 161-163. 中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南.中华肝脏病杂志,2006,14:161-163. [6]Darimont C, Avanti O, Zbinden I, et al. Liver X receptor preferentially activates de novo lipogenesis in human preadipocytes. Biochimie, 2006, 88: 309-318. [7]Brunt EM. Nonalcoholic steatohepatisis. Semin Liver Dis. 2004, 24: 3-20. [8]Lieber CS. CYP2E1: from ASH to NASH. Hepatology Res, 2004, 28: 1-11. 《中华肝脏病杂志》版权 |