【关键词】 脂肪肝； 槲皮素； 胆固醇酯类； 羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶
A study of the effects of quercetin on the expression of HMGCR and the cholesterol synthesis of HL-02 cells ZHANG Jie, YANG Xue-feng, LIAO Duan-fang, WU Qing, LIU Zhao-xia, HE Ya-di.
【Key words】 Fatty liver; Quercetin; Cholesterol esters; Hydroxymethylglutaryl CoA reductases
【First author’s address】 Department of Gastroenterology, Nanhua Hospital, Nanhua University, Hengyang 421002, China
Corresponding author: YANG Xue-feng, Email: yxf9988@126.com
槲皮素[3，3’4’，5，7-五羟基黄酮]是天然黄酮类化合物。许多研究已证实槲皮素有抗增殖、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等药理作用，且不良反应小[1]。本实验旨在检测槲皮素对胆固醇合成的作用及其相关机制，为治疗胆固醇代谢性疾病开辟新途径。
一、材料与方法
1. 主要材料：人肝L-02细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，槲皮素、MTT购于美国Sigma公司,油红“O”试剂购于南京建成公司，RT-PCR试剂盒为美国Promega公司产品，总RNA提取试剂盒（Trizol）为上海生物工程公司产品，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）和磷酸甘油醛脱氢酶引物均由上海生物工程公司合成，乙腈、异丙醇、正庚烷、正己烷（美国天地公司），高效液相色谱分析系统（美国惠普公司），BCA蛋白定量试剂（美国Pierce公司）。其他试剂均为进口或国产分析纯。
2. 方法：（1）人肝L-02细胞培养及肝脂肪变性模型的建立: 人肝L-02细胞培养接种于50ml培养瓶中，加入含体积分数10%的灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640完全培养基中，置37℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的温箱内培养，每48h换液1次，在细胞达1×109/ml时用完全培养基重新悬浮，并以1∶3的比例传代，取对数生长期细胞进行实验。实验前用无血清的RPMI 1640培养24h，使细胞周期同步化。参照范建高、曾民德方法[2]，在更换新鲜培养液后加入50%的胎牛血清，继续培养24h，即形成肝脂肪变性模型（镜像比较造模前后细胞内的脂滴变化，组织学上低倍镜下每单位面积见1/3以上的肝细胞脂肪变性和脂肪储积，无其他明显组织学改变）。加入槲皮素共同孵育24h。（2）实验分组: 实验分为正常肝细胞组（培养48h）、人肝L-02细胞脂肪变性模型组（造模24h后，再孵育24h）、小剂量组（造模24h后，加槲皮素使其终浓度为10μmol/L，共同孵育24 h）、中剂量组（造模24h后，加槲皮素使其终浓度为20μmol/L，共同孵育24h）、大剂量组（造模24h后，加槲皮素使其终浓度为40μmol/L，共同孵育24h）、普罗布考对照组（造模24h后，加普罗布考使其终浓度为10μmol/L，共同孵育24h）。实验重复5次，结果取平均值。（3）油红O染色观察细胞内脂滴变化: 将细胞培养于放有消毒盖玻片的6孔培养板内，细胞被处理后，用PBS洗3次，50%异丙醇固定1min，油红O染色液染色10min，苏木素染色5min，1％ 盐酸分色及返蓝后，HPIAS-1000型图像分析系统收集图像。（4）MTT法测定细胞增殖率：将人肝L-02细胞以每孔l04个细胞接种于96孔板中，每孔200μl。细胞培养及脂肪变性人肝L-02细胞模型的建立同方法（1）。实验按方法（2）分组处理后每孔加入MTT溶液（5g/L）20μl；37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃培养液。每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm波长下读数，测定各孔吸光度A值。按下列公式计算：增殖抑制率%＝（对照组Ａ值-实验组Ａ值）/对照组Ａ值×100%。（5）高效液相色谱分析细胞内胆固醇与胆固醇酯的含量: 将收获好的细胞用210μl裂解液裂解细胞，3000r/min离心5min，为样品。取5μl样品进样，C18反相柱，以异丙醇：正庚烷：乙腈为流动相，非梯度洗脱，1ml/min，柱温40℃，检测波长216nm，检测到第8分钟。胆固醇用外标法峰面积定性定量，单位为mg/g蛋白，胆固醇酯经胆固醇酯酶水解，测得总胆固醇量，总胆固醇减去游离胆固醇的值代表胆固醇酯的量，以mg/g蛋白为单位。（6）HMGCR mRNA的RT-PCR检测: 收集培养的细胞，按Trizol试剂的说明书，分别提取总RNA，用紫外分光光度计定量后，调整RNA的浓度为0.2g/L。RT-PCR的反应体系为：两对引物各1.0μl、10×Buffer 5μl、25mmol/L MgSO4 1μl、10mmol/L dNTP mix 0.5μl、DNA聚合酶0.5ml及逆转录酶0.5μl，用去离子水补至25μl。反应条件为：48℃ 45min, 94℃ 3min；94℃ 90s,58℃ 1min，72℃ 1min，共28个循环后，再于72℃延伸7min。取RT-PCR产物5μl，在10g/L含溴乙锭的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，在紫外灯下观察结果。RT-PCR引物序列参照文献[3]设计如下：HMGCR正义引物：5′-TACCAT GTCAGGGGTACGTC-3′，反义引物：5′-CAAGCCTA GAGACATAATCATC-3′，PCR扩增产物长度为247bp；GAPDH引物序列设计如下正义引物：5′-TCACCATCT TCCAGGAGCGAG-3′，反义引物：5′-TGTCGCTGTTG AAGTCAGAG-3′, PCR扩增产物长度为697bp。（7）统计学分析：多组数据的比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析，各组间两两比较用q检验。全部资料均用SPSS12.0统计软件进行分析。
二、结果
1. 在显微镜下，观察到模型组和低剂量组细胞质中有较多的脂滴形成，而中剂量组、高剂量组、正常组、普罗布考对照组细胞质中脂滴较少，说明中高剂量组槲皮素对细胞内的脂肪储积有一定的抑制作用，而低剂量组的作用不明显，见图1。
2. MTT法检测结果：槲皮素对脂肪变性人肝L-02细胞表现出一定的抑制作用, 抑制率：正常组82.7%、模型组10μmol/L 65.3%、20μmol/L 69.9%、40μmol/L 74.8%、普罗布考对照组80.2%。10μmol/L槲皮素组和模型组之间的差异无统计学意义。20、40μmol/L槲皮素组、普罗布考组同模型组之间比较，差异有统计学意义，F＝71.164，P<0.05。
3. 不同浓度槲皮素对细胞内胆固醇含量的影响: 槲皮素在浓度为10～40μmol/L范围内，细胞中胆固醇酯占细胞内总胆固醇的含量随槲皮素浓度的增加呈剂量依赖性减少，其中采用40μmol/L的槲皮素处理细胞后降低细胞内胆固醇酯的作用最为显著，见表1。
4. 不同剂量槲皮素对HMGCR mRNA表达的影响: HMGCR mRNA的表达（HMGCR mRNA/GAPDH，灰度值）正常细胞组为0.1258±0.0527、模型组平均为0.5524±0.1863、10μmol/L组为0.4346±0.1542、20μmol/L组为0.2847±0.0726、40μmol/L组为0.1547±0.0521、普罗布考对照组为0.1084±0.0467。40μmol/L组、20μmol/L组和普罗布考对照组HMGCR mRNA的表达较低, 与模型组比较，F＝45.326，P<0.01，差异有统计学意义。但10μmol/L组与模型组的表达水平明显增高，两组比较，差异无统计学意义，见图2。
三、讨论
人体内的胆固醇主要来自内源性途径，HMGCR是胆固醇合成的限速酶，在胆固醇合成中具有重大意义。HMGCR活性增高，肝脏合成胆固醇增多，可使胆汁中胆固醇饱和指数上升[4]。人的HMGCoA还原酶的基因位于第13号染色体上，其cDNA长约45kb，编码的HMGCoA还原酶具有888个氨基酸序列，该酶的基因表达和酶活性均受到胞内浓度的反馈调节。Fuchs等[5]研究发现C57L小鼠HMGCR mRNA水平的下调失败可能至少部分作用于高胆固醇胆汁的形成。Lea等[6]已经发现的HMGCoA还原酶抑制剂都是通过竞争性抑制HMGCoA还原酶，进而抑制甲羟戊酸形成受阻，发挥抑制内源性胆固醇的合成的作用。临床证实HMGCR抑制剂可以降低TC、TG、LDI、VLDL的血浆浓度，提高HDL的血浆浓度。因此，若抑制此酶，则胆固醇的合成减少。
槲皮素具有去痰止咳平喘，抗炎，抗过敏，解痉，强心，降血压，扩张冠脉，降血脂，抗心律失常、抗血小板聚集，抗氧化，抗肿瘤等广泛的药理作用。研究发现，槲皮素能抑制多种细胞的增殖和DNA的合成，如人成纤维细胞，内皮细胞以及肿瘤细胞。Kawaii等[7]研究了它的构效关系，表明它β环上的邻苯二酚结构和2，3位的双键对其抗增殖活性具有重要作用。然而，槲皮素对胆固醇合成的影响及其作用机制尚未见报道。本实验研究了不同浓度槲皮素对体外培养的脂肪变性人肝L-02细胞胆固醇合成的作用，结果发现槲皮素可以抑制脂肪变性人肝L-02细胞的增殖，减少其细胞内的脂滴储积，降低细胞内胆固醇酯的含量，其作用机制可能与槲皮素抑制HMGCR的表达有关。
参 考 文 献
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何娅娣,艾明,阳学风.槲皮素对大鼠肝损伤保护作用的实验研究.杭州师范学院学报(自然科学版),2005,4:165-166,176.
[2]Fan JG, Zeng MD, ed. Fatty Liver Disease. Shanghai Science and Technology Press, 2000: 153.
范建高,曾民德,主编.脂肪性肝病.上海医科大学出版社,2000:153.
[3]Cui YF, Cui NQ, Li DH, et al. Expression of HMGCR,SCP2mRNA in hereditary cholesterol gallstone patients. Shijie Huaran Xiaohua Zazhi, 2005, 13: 1115-1118.
崔云峰,崔乃强,李东华,等.家族性胆固醇结石患者肝组织HMGCR和SCP2mRNA的表达.世界华人消化杂志,2005,13:1115-1118.
[4]Roglans N, Vazquez-Carrera M, Alegret M, et al. Fibrates modify the expression of key factors involved in bile-acid synthesis and biliary-lipid secretion in gallstone patients. Eur J Clin Pharmacol,2004, 59: 855-861.
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[6]Lea AP, McTavish D, Atorrastatin, et al. A review of its pharmacology and therapeutic potential in the management of hyperlip-idaemias. Drugs, 1997, 53: 828-831.
[7]Kawaii S, Tomono Y, Katase E, et al. Acridones as inducers of HL-60 cell differentiation. Leukemia Res, 1999, 23: 263-269.
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