【摘要】 目的 检测乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）与缺氧诱导因子-1(HIF-1)α在肝癌中的表达，探讨正常氧和缺氧状态下，HBx对HIF-1α可能的调节机制。 方法 采用免疫组织化学染色方法检测78份原发性HCC组织标本中HBx和HIF-1α的表达，用SPSS10.0进行相关性分析；免疫荧光和Western blot检测常氧和缺氧条件下，HepG2及稳定转染HBx基因的HepG2细胞（HepG2-X）中HIF-1α的表达；流式细胞术检测常氧和缺氧状态下HepG2及HepG2-X细胞活性氧（ROS）的含量。 结果 78份肝癌组织标本中, HBx和HIF-1α免疫组织化学染色阳性率分别为74.36%（58/78）和69.23% (54/78)，两者表达呈正相关（r＝0.636, P<0.05）。免疫荧光检测表明：常氧状态下，HepG2细胞中HIF-1α的表达阴性而HepG2-X中表达阳性，主要位于细胞浆，部分位于细胞核，而缺氧状态下，HepG2和HepG2-X细胞的细胞质和细胞核均有表达。Western blot检测显示：常氧状态下，HepG2细胞中HIF-α几乎无表达，而HepG2-X明显表达。两者在缺氧1h开始均表达, 8h达到高峰, 16h后逐渐下降，测量两者缺氧8h时的表达，发现HepG2-X中HIF-α的表达增高。流式细胞术检测细胞ROS含量显示：在常氧状态下,HepG2-X细胞中ROS含量明显高于HepG2细胞。 在缺氧状态下,二者ROS含量无显著差异，但均明显高于常氧状态下HepG2细胞的ROS含量。 结论 HBx及HIF-1α在人肝细胞肝癌组织中广泛表达,并显著正相关；常氧或缺氧状态下，HBx均可上调HIF-1α在HepG2细胞中表达，并且HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现。
【关键词】 肝炎病毒，乙型； 癌，肝细胞； 乙型肝炎病毒x蛋白； 缺氧诱导因子-1α
Expressions of hepatitis B virus x protein and hypoxia-inducible factor-1α in hepatocellular carcinoma and their possible relationships LIU Kai-ge*, XIE Hua-hong, LIU Jie. *Affiliated Hospital of Xi抋n Medical College, Xi抋n 710077, China
Email: kaigeliu@gmail.com
【Abstract】 Objective To investigate the expressions of hepatitis B virus x protein (HBx) and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and HepG2 cells under normoxic and hypoxic conditions. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of HBx and HIF-1α in 78 hepatic carcinoma tissues, and their possible relationships were analyzed using SPSS 10.0 statistical software. Immunofluorescence and Western blot were used to investigate the expression of HIF-1α in HepG2 and HepG2-X cells under normoxic and hypoxic conditions. Flow cytometric analysis was used to measure reactive oxygen species (ROS) in HepG2 and HepG2-Xd cells under normoxic and hypoxic conditions. Results The positive rate of HBx in the hepatocellular carcinoma tissues was 74.36% (58/78), while the positive rate of HIF-1α was 69.23% (54/78). Under normoxic condition, HIF-1α was mainly localized in the cytoplasm and partially translocated into the nuclei of most HepG2-X cells, while under hypoxic condition the expression of HIF-1α was positive in the cytoplasm and nuclei of HepG2 and HepG2-X cells. Under normoxic condition the expression of HIF-1α was negative in the HepG2 cells while it was positive in HepG2-X cells, but HIF-1α was upregulated time-dependently in both HepG2 and HepG2-X cells under hypoxia condition. Furthermore, HepG2-X cells had a higher level of ROS than HepG2 cells under normoxic condition, while under hypoxic condition, the levels of ROS in HepG2 and HepG2-X cells were not significantly different, but the levels of ROS in HepG2 and HepG2-X cells under hypoxia condition were higher than those under normoxia condition. Conclusion HBx and HIF-1α were widely expressed in HCC tissues and there is a positive relationship between them. HIF-1α can be upregulated by HBx in HepG2 cells under normoxic and hypoxia conditions. Regulation of HIF-1α by HBx in HCC might be via the ROS pathway.
【Key words】 Hepatitis B virus; Carcinoma, hepatocellular; Hepatitis B virus X protein; Hypoxia-inducible factor-1α
HCC是我国最常见的恶性肿瘤之一，HBV作为HCC的致病因子已被公认[1],其x基因编码产物x蛋白（HBx）在HBV相关的HCC形成过程中发挥重要作用。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1) 是一种分布和作用非常广泛的真核细胞转录因子，其α亚单位HIF-1α存在于缺氧细胞的细胞核中，参与缺氧诱导的特异反应，促进多种基因转录。HIF-1还能够诱导多种参与肿瘤增殖和转移的酶的表达，促进肿瘤的增殖和转移[2, 3]。因此，HIF-1的表达与肿瘤的发生发展密切相关。我们就肝癌组织中HBx蛋白对HIF-1α表达的调节作用及可能的调节机制进行了探讨。
材料与方法
1. 材料和试剂：78份人肝癌组织来源于第四军医大学西京医院病理科。人肝癌细胞系HepG2及HepG2-X为第四军医大学西京医院肿瘤生物学国家重点实验室保存。主要试剂：10%小牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）、1640培养基、Triton-X 100及BSA（美国Gibco公司产品），鼠抗HIF-1α单克隆抗体及鼠抗HBx单克隆抗体（美国NeoMarkers公司产品）,免疫组织化学S-P试剂盒、荧光标记及辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体（北京中山生物工程公司产品），β-actin及DCFH-DA（美国Sigma公司产品），化学发光法显色试剂(美国Pierce公司产品)。
2．免疫组织化学检测：S-P法检测人肝癌组织中HIF-1α的表达。按常规步骤进行，其中鼠抗HIF-1α单克隆抗体为1∶400，以PBS代替第一抗体作为阴性对照。结果判定:镜下细胞呈棕黄色染色而背景无染色为阳性细胞。0分为阳性细胞数小于10%或细胞染色和背景染色相同；1～4分为阳性细胞数分别为10%～30%；4～8分为阳性细胞数>30%。
3．细胞培养：HepG2及HepG2-X细胞常规置于37℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。其中缺氧状态用1% O2、5% CO2和94% N2模拟，缺氧时间分别为1、2、4、8、16h和32h。
4.免疫荧光检测HepG2及HepG2-X细胞中HIF-1α的表达：将单层培养的细胞用95%的乙醇溶液固定20min，PBS洗5min×2次；0.25% Triton-X 100处理15～20min，HBx单克隆抗体（1∶200）和HIF-1单克隆抗体（1∶50），湿盒中4℃孵育过夜。PBS洗2次，再滴加荧光抗体（1∶2000），37℃孵育30min，PBS洗2次，缓冲甘油封固，镜检。阴性对照：用正常鼠血清代替第一抗体。
5.Western blot法检测：细胞生长密度达到培养皿的70%～80%时，冷PBS洗涤细胞3次，冰上操作收集细胞，三去污裂解液裂解。4℃ 12000r/min离心15min，上清液蛋白定量、变性电泳。8% SDS-PAGE中蛋白分离后,电转移至硝酸纤维素膜，10%脱脂奶粉室温封闭2h，加入HIF-1α（1∶100）和β-actin（1∶2000）4℃孵育过夜。TBST洗膜，15min×3次。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠第二抗体（1∶2000）室温孵育3h,洗膜,15min×3次，化学发光法显色。
6.测定活性氧：收集细胞后用缓冲液A（150mmol/L NaCl, 6mmol/L KCl, 10mmol/L HEPES, 1mmol/L MgCl2，5.5mmol/L glucose，0.2% BSA）制成悬浮液2ml，加入DCFH-DA（10μg/ml）37℃孵育20min，孵育结束后，用缓冲液B（150mmol/L NaCl，6mmol/L KCl，10mmol/L HEPES，1mmol/L MgCl2，5.5mmol/L葡萄糖）洗脱2次，再用缓冲液B制成悬浮液1ml，流式细胞仪检测。其参数：激发光波长范围：400～500nm，检测绿色荧光波长范围：500～530nm。
结 果
1.免疫组织化学染色检测肝癌组织中HBx和HIF-1α表达: HBx表达主要位于细胞浆而HIF-1α在细胞浆和细胞核中均有表达，见图1。阳性切片中，肿瘤细胞的阳性着色率均在70.00%以上。78 例肝癌组织标本中, HBx和HIF-1α免疫组织化学染色阳性率分别为74.36%（58/78）和69.23%（54/78）；在同一标本切片中,两者表达有很好的符合性。将阳性结果评分后应用SPSS10.0统计学软件进行相关性分析：r＝0.636, P<0.05，二者之间呈正相关。
2．免疫荧光检测结果：正常氧状态下，HIF-1α在HepG2-X中表达阳性，并且主要位于细胞浆，部分位于细胞核，但在HepG2中表达阴性。在缺氧状态下，HIF-1α在HepG2-X和HepG2细胞的细胞质和细胞核均完全表达，见图2。
3．Western blot法检测：在常氧状态下，HIF-1α在HepG2-X细胞中显著表达，但在HepG2细胞中几乎无表达。在缺氧状态下，即细胞氧张力降低的情况下，二者在缺氧1h开始HIF-1α均有表达, 8h达到高峰, 16h后下降。在缺氧8h时，HIF-1α在HepG2-X和HepG2细胞中均有表达，且HIF-α在HepG2-X细胞中的表达水平均高于在HepG2中的表达水平。见图3。
4. 流式细胞术检测细胞ROS含量结果：在常氧状态下，HepG2-X细胞中ROS含量明显高于HepG2细胞。在缺氧状态下,二者ROS含量差异无统计学意义，但均明显高于常氧状态下HepG2细胞的ROS含量。见图4。
讨 论
HBV的长期慢性感染是HCC发生的一个重要原因。x基因是HBV基因组中四个开放读码框之一，其编码的蛋白HBx具有反式激活作用,能促进多种肿瘤相关基因的表达,与HBV相关的HCC的发生发展密切相关[4]。HIF-1为一种含α和β两个亚单位的异二聚体，作为转录因子，它能调节氧平衡及细胞对缺氧的生理反应[5]。研究发现，HIF-1α与肿瘤的发生、肿瘤细胞的生长、增殖关系密切[6，7]。HIF-1还能够诱导多种参与肿瘤增殖和转移的酶的表达，促进肿瘤的增殖和转移，进而影响肿瘤患者的预后。国内外许多学者检测了不同肿瘤组织中HIF-1α的表达情况，发现多种肿瘤组织中HIF-1α呈阳性表达，甚至在某些癌前病变中HIF-1α也有表达，同时，转移灶中多数出现过表达[8]。Moon等[9]的研究表明HBx可以通过稳定HIF-1α来诱导肝癌的血管生成，Lee等[10]的研究进一步说明HBx有可能通过HIF-1α作用于下游基因，对肝癌组织的血管形成起重要的作用。我们进一步采用免疫组织化学染色检测显示肝癌组织中HBx和HIF-1α均表达，HBx主要表达于细胞浆而HIF-1α在细胞浆和细胞核中都有。并且在同一标本中，两者表达有很好的符合性。相关性分析提示两者之间呈正相关。免疫荧光检测发现在转染x基因的肝癌细胞中，无论正常氧或缺氧状态下，HBx能激活HIF-1α在HepG2-X细胞中的表达。上述结果表明，在肝癌细胞中，HBx基因的整合和表达可以上调HIF-1α基因的表达。本研究结果在组织学上进一步证明了HBx和HIF-1α之间的关系，并且HIF-1α可能是HBx的一个下游分子，HBx可能通过上调HIF-1α进而调节其下游的分子对肝癌细胞的恶性行为产生重要影响。但HBx调节HIF-1α的具体机制还没有完全阐明。Yoo等[11]发现HBx通过MAPK通路增强HIF-1α的转录活性。此外HBx也可通过抑制HIF-1α降解途径来实现对HIF-1α的调节。Volm等[6]研究发现HBx能够作用于HIF-1α的bHLH/PAS区域，使PVHL与HIF-1α的结合降低，阻止了HIF-1α经泛素-蛋白酶复合体途径降解。Yoo等[12]进一步研究也发现HBx能够通过其C末端作用于VHL抑制HIF-1α的降解。但上述两种机制仍不能完全解释HBx对强HIF-1α的调节。Sauer等[13]研究发现主要包括超氧阴离子、过氧化氢及氢氧根等在内的ROS作为第二信使与其他蛋白或基因发生联系，继而通过MAPK和（或）PI3K通路激活HIF-1α。Park等[14]的研究发现胃癌上皮细胞线粒体产生的ROS可抑制HIF-1α在常氧状态下的降解。Michels等[15]发现缺氧状态下线粒体呼吸链产生的ROS可稳定HIF-1α的表达。而HBx也可通过作用于线粒体影响细胞内ROS的含量。Rahmani等[16]研究发现细胞浆中的部分HBx与线粒体作用，其结果导致线粒体的膜电位降低诱导ROS产生。Lee等[17]也发现HBx可抑制呼吸链复合体酶，从而抑制呼吸链的电子传递，增强肝癌细胞线粒体内ROS的生成水平，导致有氧氧化代谢及三磷酸腺苷供应受阻。我们的实验证实常氧状态下,HBx转染的HepG2细胞中的ROS含量较HepG2细胞升高，这与HIF-1α在二者中的表达结果一致,提示常氧状态下,HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现。缺氧状态下的HepG2、HepG2-X及常氧状态下HepG2-X细胞三者ROS含量无明显的差异，但较常氧状态下HepG2的ROS含量显著增高，与同等条件下的HIF-1α表达结果一致，同样提示HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现。
HBx及HIF-1α在人HCC组织中广泛表达,并且密切相关；无论常氧或缺氧状态下，HBx均可上调HIF-1α在HepG2细胞中表达；HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现。本研究对于进一步阐明HBx的致癌机制具有重要的意义。
参 考 文 献
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