【摘要】目的探讨瘦素对肝星状细胞（HSCs）合成Ⅲ型胶原的影响以及与细胞外信号调节激酶(ERK)信号传导通路之间的关系。方法用培养的大鼠肝星状细胞（HSC-T6）作对照，观察加入瘦素、瘦素＋ERK抑制剂PD98059后细胞的Ⅲ型胶原合成变化。用ELISA方法测定Ⅲ型胶原，用Western blot测定pERK1/2及ERK1/2的表达变化。结果瘦素能明显刺激HSCs pERK1/2及ERK1/2的表达，并促进HSCs Ⅲ型胶原的合成。PD98059则能明显抑制瘦素刺激的pERK1/2及ERK1/2的表达，并阻断瘦素刺激的HSC Ⅲ型胶原的合成（P<0.01）。结论瘦素可刺激HSCs 合成Ⅲ型胶原，这种作用可能通过ERK1/2信号传导通路起作用。 【关键词】肝纤维化； 肝星状细胞； 细胞外信号调节激酶； 瘦素 Effect of extracellular regulated kinase signaling pathways on leptin stimulated typeⅢ collagen synthesis of hepatic stellate cellsWANG Yaojun, ZHANG Zhongbing, ZHU Yingwei, et al.Department of Gastroenterology, Affiliated Changzheng Hospital, Second Military Medical University. Shanghai 200003, China 【Abstract】ObjectiveTo study the effect of leptin on type Ⅲ collagen synthesis and the relationship between leptin and extracellular regulated kinase (ERK) signaling pathways in hepatic stellate cells (HSCs).MethodsCultured HSCs were treated with DMEM, leptin, leptin + PD98059 respectively. pERK and ERK expressions were determined in HSCs by Western blot, and collagen type Ⅲ were examined by ELISA.ResultsLeptin promoted pERK, ERK expressions and stimulated the type Ⅲ collagen synthesis in HSCs. PD98059 suppressed pERK, ERK expressions and type Ⅲ collagen synthesis in HSCs(P<0.01).ConclusionLeptin can stimulate the type Ⅲ collagen synthesis in HSCs, which could be regulated by the ERK signaling pathways. 【Key words】Liver fibrosis； Hepatic stellate cells； Extracellular signal regulated kinase； Leptin 近年来,肝星状细胞(HSCs)信号传导一直是肝纤维化发病机制中研究的热点。细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)信号通路参与调控细胞增殖与分化,是多种信号交汇点或共同通路。瘦素是由肥胖基因(ob基因)编码的一种主要由白色脂肪组织产生的荷尔蒙,主要作用于大脑调节食物摄取,控制体重，并对代谢、心血管和肾脏功能，某些器官正常或疾病状态下的生长、修复等产生广泛的生物学效应。近年发现它在纤维化肝脏中有表达，可能与肝纤维化有着密切的关系。瘦素在HSCs活化中的作用尚不清楚。我们观察了瘦素以及特异性MEK1阻断剂PD98059阻断ERK活性后对瘦素刺激的HSCs Ⅲ型胶原分泌的影响,探讨瘦素对HSCs合成胶原的影响以及ERK信号通路在调控瘦素刺激的HSCs活化中的意义,为肝纤维化的防治提供理论依据。 材料与方法 一、材料 肝星状细胞株HSC-T6由UCSF肝脏中心实验室Friedman教授惠赠，其表型为活化的HSCs。DMEM培养基、10×Trypsin为Gibco BRL产品，鼠抗大鼠pERK单克隆抗体、兔抗鼠ERK抗体为Cell Signaling产品。瘦素、ELISA试剂盒为Sigma产品。PD98059系Calbiochem产品。 二、方法 （一） 实验分组用1×胰酶消化HSCs细胞,制成浓度为1.6×105/ml细胞悬液,每孔0.5 ml,接种于24孔培养板中，细胞丰度约80％,培养24 h后分为空白对照组、瘦素组和实验组，每组6个复孔。先弃去培养基,PBS液冲洗2次,加无血清DMEM培养液后加药：空白对照组(A组)加不含血清的DMEM培养液；瘦素组(B组)培养液中加瘦素到终浓度为200 ng/ml；实验组(C组)在B组基础上加入PD98059(培养液中加入PD98059到终浓度为20 μmol/L)；再培液24 h，中止培养。收集培养上清液进行Ⅲ型胶原蛋白ELISA法检测，细胞裂解产物进行western blot。 （二）ELISA法定量测定Ⅲ型胶原按上述分组,收集细胞上清液,按说明书操作。培养上清液取100 μl，加入已包被抗Ⅲ型胶原单克隆抗体的96孔微板。依次加入50 μl第一抗体工作液、100 μl酶标抗体工作液、100 μl底物工作液及中止液，酶标仪测定A492值，依照标准曲线测定胶原浓度。 （三） Western blot方法培养的细胞吸去上清液后，PBS洗2遍，每孔加入20 μl 2×细胞裂解液4℃裂解细胞提取总蛋白,测蛋白含量、样品处理,每孔取40μg蛋白，SDS-PAGE电泳分离,电转仪移至聚二氟乙烯(PVDF)膜上,3%BSA+2%脱脂奶粉/PBST封闭，第一抗体加入鼠抗pERK1/2, 4℃孵育过夜,洗膜,分别加荧光标记的鼠抗鼠第二抗体,荧光扫描仪扫描，测定pERK1/2灰度值。PVDF膜经抗体洗脱后，按上述方法依次加入鼠抗β-actin、兔抗ERK1/2，并分别计算灰度值。pERK1/2、ERK1/2的灰度值与β-actin灰度值的比值作为各自的相对含量。 三、统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析。 结果 一、瘦素及PD98059对HSCs合成Ⅲ型胶原的影响 瘦素明显刺激HSCs Ⅲ型胶原蛋白分泌。加入PD98059后,细胞的Ⅲ型胶原蛋白分泌受到抑制,结果见表1。 表1（略） 二、瘦素及PD98059对pERK1/2及ERK1/2表达的影响(见图1～3略)。 讨论 近来发现，瘦素可存在于胎盘和胃等脂肪组织以外的组织，具有广泛的生物学效应。有作者发现［1］，瘦素缺乏小鼠不能够诱导肝纤维化，认为瘦素是慢性肝损伤引起的肝纤维化的必须因子。最新的一些临床与实验研究显示，活化的HSC瘦素mRNA和蛋白质合成增加，慢性病毒性肝炎、肝硬化患者血清瘦素水平升高，酒精性肝硬化患者血中瘦素水平亦明显升高。因此，瘦素与肝纤维化可能有着密切的关系［2］。 我们的研究曾证实,正常肝组织无瘦素蛋白的表达，在二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化模型中，第1周瘦素蛋白虽然中央静脉内皮细胞以及极少数的窦周细胞有表达，但非常低，随肝纤维化的加重而逐渐明显。在肝纤维化最顶峰时（第3周F3～F4），表达也最明显。RTPCR结果提示，瘦素可能与肝纤维化的进展有关，它在肝纤维化的中晚期起主要作用。 近年来,丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)作为一种转录激活因子可以易位核膜介导信号由胞质向核内传导,其通路的核心是由3种蛋白激酶(MAPKKK,MAPKK,MAPK)构成的蛋白激酶反应链,其中,MAPKK(包括其上游成分)可以被好几个蛋白激酶所催化,可能是好几种信号途径的汇集点,而MAPK作为迄今惟一可以易位核内并激活转录因子的蛋白激酶成为信号转导的“瓶颈”,MAPK信号转导通路也被认为是许多信号通路的共同通道［3］。MAPK家族包括P44/P42ERK（分别为ERK1/2）、JNK和p38等,其中,ERK是其主要成员。ERK1/2通过磷酸化转化为pERK1/2而发挥信号传导的生物学功能。 HSCT6是一种永生化的激活肝星状细胞，多用于肝纤维化的细胞学研究，但瘦素对HSCT6合成胶原有无影响，是否通过ERK信号传导通路起作用等，目前尚不清楚。 Ⅲ型胶原的大量合成是早期肝纤维化的特征，也是活化的HSCs重要表型。胶原测定结果显示，HSCT6培养细胞中加入瘦素，Ⅲ型胶原的合成明显增加，加入瘦素的同时加入ERK激酶(MEK)抑制剂PD98059可以明显抑制瘦素引起的Ⅲ型胶原合成。免疫印迹结果显示，瘦素可明显刺激HSCT6 pERK1/2（即ERK1/2的磷酸化）和ERK1/2表达，PD98059同样能抑制瘦素引起的pERK1/2和ERK1/2表达。ERK1/2的表达与pERK1/2呈现相似的表达规律。值得注意的是,PD98059几乎完全抑制了pERK的表达即ERK的磷酸化，但对于Ⅲ型胶原的合成并未抑制到对照组水平,与对照组仍存在明显差异(P<0.01),提示ERK并非是调控瘦素刺激HSCs合成胶原的惟一通路。最近Janulis等［4］又发现了一个新的MAPK家族成员p97。虽然这些MAPK家族中各成员的信号传导过程尚不完全明确,但已有报道显示,JNK和p38也一定程度参与调控HSCs激活、生长调节及胶原合成［5］，这也许可以解释阻断ERK的磷酸化并不能完全阻断胶原合成。 参考文献 1Leclercq IA, Farrell GC, Schriemer R, et al. Leptin is essential for the hepatic fibrogenic response to chronic liver injury.J Hepatol, 2002,37∶206-213. 2王要军，谢渭芬，张忠兵.瘦素在肝纤维化中的作用.国外医学外科学分册，2005，32∶248-252. 3Reimann T, Hepmpe lU, Kraulwald S, et al. Transforming growth factor β1 induces activation of Raf 1, MEK and MAPK in rat hepatic stellatecells. FEBS Lett, 1997，403∶57-60. 4Janulis M, Trakul N, Greene G, et al. A novel mitogen activated protein kinase is responsive to Raf and mediates growth factor specificity. Mol Cell Biol, 2001，21∶2235-2247. 5Schnabl B, Bradham CA, Bennett BL, et al. TAK1/JNK and p38 have opposite effects on rat hepatic stellate cells. J Hepatol, 2001，34∶953-963. 《肝脏》版权 |