【摘要】 目的 观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）的天然配体15d-PGJ2对HSC增殖及活化的影响，以探讨PPARγ在HSC活化过程中的作用。 方法 采用MTT法和RT-PCR方法观察5μmol/L及10μmol/L 15d-PGJ2对体外培养的HSC自发活化及血小板衍生生长因子（PDGF）引起的HSC增殖及活化的影响。 结果 以5μmol/L 15d-PGJ2处理原代HSC 3d后，可明显抑制HSC活化标志物α-平滑肌肌动蛋白的表达，而PPARγ的表达较未处理组明显增高（0.64±0.03对比0.09±0.01，t＝36.0517，P<0.01）；15d-PGJ2可剂量依赖性地抑制PDGF引起的HSC增殖；经5μmol/L和10μmol/L 15d-PGJ2预处理后再用PDGF干预，则PPARγ的表达较单用PDGF干预组明显增高（分别为0.03±0.02对比0.60±0.03，t＝42.6616，P<0.01；以及0.03±0.02对比0.69±0.04，t＝33.83，P<0.01），而HSC的活化指标α-平滑肌肌动蛋白、α1（I）型胶原及单核细胞趋化蛋白-1的表达则受抑制。 结论 激活PPARγ可调控HSC的促纤维化和促炎症作用，促进PPARγ的表达可能成为抗肝纤维化的新手段。
【关键词】 肝纤维化； 肝星状细胞； 大鼠； 过氧化物酶体增殖物活化受体γ
The effect of ligand of peroxisome proliferators-activated receptor gamma 15d-PGJ2 on the proliferation and activation of hepatic stellete cells YANG Wen-zhuo*, LIU Rui-lin, ZENG Min-de, LU Lun-gen, FAN Zhu-ping, XU Shu-chang, WANG Sheng-lan, YANG Li. *Department of Gastroenterology, Tongji Hospital of Tongji University, Shanghai 200065, China
Corresponding author: LIU Rui-lin
【Abstract】 Objective To observe the effect of ligand of peroxisome proliferators-activated receptor gamma (PPAR gamma) 15d-PGJ2 on the proliferation and activation of hepatic stellete cells (HSC) and to study the role played by PPAR gamma during the process of HSC activation. Methods By using RT-PCR and cell culture, we investigated the effects of 5μmol/L and 10μmol/L 15d-PGJ2 on culture-activated HSC and on PDGF-induced HSC proliferation, production of extracellular matrix and expression of chemokines. Results The expression of alpha-SMA was significantly suppressed by 5μmol/L 15d-PGJ2, and the expression of PPAR gamma was significantly higher in the 15d-PGJ2 treated group than in the untreated group (0.64±0.03 vs 0.09±0.01, t = 36.0517, P < 0.01); PDGF-induced HSC proliferation was dose-dependently suppressed by 15d-PGJ2; the expressions of PPAR gamma in 5μmol/L and also in 10μmol/L 15d-PGJ2 plus PDGF pre-treated group increased much more than those in the PDGF-treated group (0.03±0.02 vs 0.60±0.03, t = 42.6616, P < 0.01 and 0.03±0.02 vs 0.69±0.04, t = 33.83, P < 0.01); the expressions of alpha-SMA, alpha 1 (I)-collagen and MCP-1 were suppressed. Conclusion Activation of PPAR gamma can modulate pro-fibrotic and pro-inflammatory roles of HSC and the increased expression of PPAR gamma may become a new target for antifibrosis.
【Key words】 Liver fibrosis; Hepatic stellete cells; Rat; Peroxisome proliferators-activated receptor gamma
过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）是一类核转录因子，与视黄酸X受体形成异二聚体后与靶基因启动子区的过氧化物酶体反应元件（peroxisome proliferator resposive element，PPRE）结合而调控基因转录。近年研究表明PPARs是肝内重要的调节分子，在肝脏脂质代谢调节方面发挥重要作用[1]。PPARs有α、β、γ3种亚型，其中 PPARγ成脂作用最强，参与脂肪细胞的分化。PPARγ在纤维母细胞中异位表达可诱导脂肪细胞分化的全过程，呈现脂质蓄积及诱导脂肪细胞特异性基因（如脂素）。我们前期的研究结果显示：PPARγ的表达参与HSC静止表型的维持，且PPARγ表达降低是HSC由静止向活化表型转化过程的早期事件[2]。本研究旨在通过观察PPARγ的天然配体15d-PGJ2对HSC增殖及活化的影响，以进一步探讨PPARγ在HSC活化过程中的作用。
材料与方法
一、材料
1. 动物：雄性Wistar大鼠购于中国科学院实验动物研究中心，体重为400～450g。
2. 主要试剂：重组大鼠PDGF-BB为美国R&D 公司产品；15-deoxy-△12，14 Postglandin J2（15d-PGJ2）为美国Cayman Chemical公司产品；胎牛血清购自上海浦东开发区高桥兽医站；Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶E（Pronase E）、Nycodenz为美国Sigma公司产品；焦碳酸二乙酯为美国Amresco公司产品；Trizol为美国Gibco BRL公司产品；M-MLV逆转录酶为美国Promega公司产品；随机六聚体引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、RT-PCR引物由上海生工生物工程公司提供；MTT为美国Amresco公司产品；DMSO为美国Fluka公司产品。
二、方法
1. HSC的分离: 采用原位肝脏二步酶灌注法[3]。
2. 15d-PGJ2毒性实验：15d-PGJ2用前在低流量氮气下将原溶剂蒸发，换以DMSO为溶剂。以台盼蓝拒染实验判断15d-PGJ2及其溶剂DMSO对细胞活力的影响。将新鲜分离的HSC接种于24孔板，待80%汇合时，以1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L 15d-PGJ2及0.1% DMSO分别处理细胞24h，以单纯DMEM完全培养基培养的细胞为对照组，每组设4个复孔。24h末收集悬浮细胞，贴壁细胞以0.125%胰蛋白酶消化，二者混合，以台盼蓝染色，血细胞计数板计数，计算细胞活力。
3. 15d-PGJ2对HSC自发活化的影响：将新鲜分离的HSC用含15％胎牛血清的DMEM完全培养液以1×106个细胞接种于6孔板，培养3～4d后，以含或不含5μmol/L 15d-PGJ2的DMEM完全培养基继续培养3d，每组设3个复孔，每天换液1次。3d后终止培养，收集细胞抽提RNA。实验重复2次。
4. 15d-PGJ2对血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF）引起的HSC增殖活化的影响：将新鲜分离的HSC用含15％胎牛血清的DMEM完全培养液以1×106个细胞接种于6孔板，以提取RNA，每组设3个复孔；实验重复2次。以2×104个细胞接种于96孔板，以备MTT分析。培养至细胞达70%～80%汇合时，以无血清DMEM培养基培养48h以使细胞同步化。然后按下列组别进行干预。对照组（以DMEM完全培养基培养）、PDGF干预组（用含PDGF 10ng/ml的DMEM培养基干预）、15d-PGJ2+ PDGF干预组（用PDGF干预前，先以5μmol/L、10μmol/L 15d-PGJ2处理细胞30min，再以10ng/ml PDGF处理细胞18h）。
5. MTT法测HSC的增殖：96孔板中，以上各组细胞各设6个复孔。待干预完毕后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，37℃继续孵育4h，弃上清液，每孔加入DMSO 150μl，37℃下置摇床振荡20min，然后将96孔板置酶标仪上，测取570nm、630nm处吸光度值（A值）。
6. RNA抽提：吸弃培养上清液，以PBS洗1次，加1ml Trizol，反复吹打细胞后，移入Eppendorf管，室温放置5min；加0.2 ml氯仿，剧烈震荡，室温孵育后4℃ 12000×g离心，将水相转移至另一Eppendorf管；加异丙醇0.5ml，室温孵育后离心去上层，加1ml 75%乙醇，旋涡混匀；4℃ 7500×g离心，真空干燥，用无RNase水溶解RNA，紫外分光光度仪检测RNA纯度及浓度（A260/A280＞1.8）， -70℃保存。
7. RT-PCR扩增：（1）逆转录cDNA：RNA 2μg+随机引物1μg+去离子水至总体积12μl，70℃水浴5min，立即冰浴，离心，按顺序加入逆转录缓冲液5μl+dNTPs 1μl+RNAase抑制剂25U+MMLV 200U+去离子水至总体积25μl，37℃水浴60min，95℃水浴5min，cDNA置-20℃保存。（2）PCR扩增：PPARγ引物序列：正义链为5′-AACCGGAA CAAATGCCAGTA-3′，反义链为5′-TGGCAG CAGTGGAAGAATCG-3′；β-actin引物序列：正义链为5′-GATGGTGGGTAT GGGTCAGAAGGA-3′，反义链为5′-GCTCATTGCCGATAGTGAT GACCT-3′。扩增条件：94℃变性3min后，94℃ 60s，54℃ 90s，72℃ 2min，共35个循环，72℃延伸10min。α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）引物序列：正义链为5′-TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3′，反义链为5′-GATCACCTGCCCATCAGG-3′；α1（1）型胶原引物序列：正义链为5′-ACAGCACGCTTGTGGAT-3′，反义链为：5′-GTCTTCAAGCAAGAGGACC A-3′；单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的扩增引物序列：正义链为 5′-GAACCAGGATTCACAGAG-3′，反义链为5′-ATGCAGGTATATGTCACGC-3′。扩增条件：94℃变性3min后，94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 90s，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物采用15g/L琼脂糖电泳（含EB），生物电泳图像分析系统分析结果。
8．统计分析：采用SmartView凝胶分析程序，以β-actin作内对照，PPARγ条带相对表达量= PPARγ条带信号密度值/β-actin条带信号密度值，数据以x-±s表示，用非配对资料t检验进行统计分析，P＜0.05及P＜0.01为有统计学意义。
结 果
1．15d-PGJ2的毒性实验：为排除15d-PGJ2对HSC的作用是由于其细胞毒性所致，台盼蓝拒染实验判断其对细胞活力的影响结果显示，以0.1% DMSO及1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L 15d-PGJ2处理的细胞，活力与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，15d-PGJ2对HSC无毒性作用。
2．15d-PGJ2对体外培养HSC自发活化的影响：RT-PCR结果见图1。以15d-PGJ2处理原代HSC 3d后，可显著抑制HSC活化标志物α-SMA的表达，而PPARγ的表达较未处理组明显增高（0.64±0.03对比0.09±0.01，t＝36.0517，P<0.01），诱导PPARγ的表达可抑制体外培养的原代HSC的自发活化。
3．15d-PGJ2对PDGF引起的HSC增殖的影响：MTT检测结果显示，对照组、PDGF组、15d-PGJ2（5μmol/L）+ PDGF处理组和15d-PGJ2（10μmol/L）+PDGF处理组分别为0.51±0.02，0.73±0.03，0.57±0.01和0.53±0.02，各处理组与对照组比较，P值均＜0.01。可见PDGF刺激HSC的增殖，而15d-PGJ2可抑制PDGF引起的HSC增殖，此作用呈剂量依赖性。
4．15d-PGJ2对PDGF引起的HSC活化的影响：RT-PCR结果见图2。PDGF处理HSC后，活化标志物α-SMA较对照组表达增强，HSC胶原合成能力标志物α1（1）型胶原mRNA表达增强，HSC迁移性标志物MCP-1 mRNA的表达亦见增高，相反，PPARγ的表达却明显降低（0.76±0.03 对比0.03±0.02，t＝45.2593，P<0.01）。经15d-PGJ2预处理后再用PDGF干预，则PPARγ的表达较单用PDGF干预组明显增高（分别为0.03±0.02对比0.60±0.03，t＝42.6616，P<0.01；0.03±0.02对比0.69±0.04，t＝33.83，P<0.01）而HSC的活化指标α-SMA、α1（1）型胶原及MCP-1的表达则受抑制。
讨 论
肝星状细胞是肝纤维化形成过程中过量合成和分泌细胞外基质及致肝纤维化细胞因子的主要细胞成分[4]。HSC是窦周间质细胞，在生理状态下，以细胞内含有大量维生素A脂滴为特征。各种肝损伤持续作用时，HSC将发生形态学及基因表达的改变，即HSC逐渐丢失维生素A脂滴、α-SMA表达增加及细胞外基质合成增加，并获得了增殖、向损伤区域迁移及分泌化学活性物质而募集炎性细胞的能力[5]。HSC的增殖、迁移以及趋化因子的分泌是促进肝纤维化时炎症和纤维沉积等病理过程形成的重要因素。PDGF是肝损伤修复反应中最强的促HSC增殖的细胞因子，可引起HSC的活化，表现为HSC脂滴丢失，活化标志物α-SMA、α1（1）胶原及反应HSC迁移性的趋化因子MCP-1表达增加。虽然调控HSC增殖及致纤维化的机制研究很多，但HSC向肌成纤维细胞转化的细胞内调控机制仍不清楚。
PPARγ是核受体超家族一员，是配体依赖的转录因子[6]，主要表达于脂肪组织中，在脂肪形成过程中起关键作用[7]。PPARγ的激活剂包括多聚不饱和脂肪酸的氧化代谢产物、前列腺素J系列，如15d-PGJ2，后者是强激活剂[8]。完整的细胞和细胞器均可产生15d-PGJ2，是PPARγ生理状态下内源性配体的代表。研究表明，PPARγ的配体15d-PGJ2及抗糖尿病药噻唑烷二酮可诱导肌成纤维细胞表达该受体，抑制细胞增殖并诱导脂肪形成。而且，在PPARγ活化因子作用下，逆转录病毒介导的PPARγ的表达可使肌成纤维细胞表达α-SMA下降，并使肌源细胞（myogenic cells）向脂肪细胞转化。鉴于PPARγ在脂肪细胞分化过程中的作用，本实验部分研究探讨了PPARγ是否参与了HSC的转化，以及是否对有丝分裂原介导的活化细胞的增殖起调控作用。
我们在既往实验中利用体外培养活化及在体活化两种方法证实HSC PPARγ表达的丧失伴随着该细胞向活化表型的转化，提示PPARγ在维持HSC静止表型方面起关键作用，且PPARγ表达减低是HSC活化的早期事件[2]。
本研究结果提示PPARγ的活化可调节HSC的多种生物学反应，包括肝脏炎症反应、纤维形成等。用内源性配体15d-PGJ2刺激HSC可抑制原代培养及PDGF诱导的HSC活化过程中α-SMA的表达。以15d-PGJ2短暂刺激PPARγ的表达可抑制PDGF引起的HSC增殖、胶原合成及趋化因子的产生，这3个反应均与肝损伤修复及纤维化形成有关。在HSC活化早期，PPARγ的减低以及PPARγ配体可抑制HSC活化表型的出现进一步提示PPARγ对于维持HSC静止表型有重要作用。这一结果与PPARγ在其他细胞体系中可控制细胞分化及表型的结果一致[9]。
15d-PGJ2抑制HSC分泌MCP-1表明PPARγ能影响趋化因子的表达。MCP-1在招募白细胞向肝脏游走过程中的作用越来越受重视。HSC活化时MCP-1等趋化因子在一些可溶性促炎症因子的诱导下表达明显增加，提示这类物质在肝脏炎症形成过程中起关键作用。最近的研究结果表明PPARγ激活剂可抑制单核细胞的活化[10]，提示 PPARγ对抑制肝脏炎症形成亦有重要作用。PPARγ作为调节HSC生物学功能的因子，要阐明其可能的调控机制还有大量的工作要做。静止的HSC表达高水平的PPARγ，除前列腺素J系列外，尚须发现新的内源性PPARγ激活剂。明确静止HSC是否合成这些化合物以及活化过程中这些物质是否同时减低是很有意义的。
参 考 文 献
[1]Tanaka T, Masuzaki H, Nakao K. Role of PPARs in the pathophysiology of nonalcoholoic fatty liver disease. Nippon Rinsho, 2005, 63: 700-706.
[2]Yang WZ, Liu RL, Zeng MD, et al. The role of peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPARγ) during activation of hepatic stellate cells. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2004, 12: 216-218.
杨文卓,刘瑞麟,曾民德,等.过氧化物酶体增殖物活化受体γ在肝星状细胞活化过程中的动态演变.中华肝脏病杂志,2004,12:216-218.
[3]Ramm GA. Isolation and culture of rat hepatic stellate cells. J Gastroenterol Hepatol, 1998, 13: 846-851.
[4]Sato M, Suzuki S, Senoo H. Hepatic stellate cells: unique characteristics in cell biology and phenotype. Cell Struct Funct, 2003, 28: 105-112.
[5]Kershenobich Stalnikowitz D, Weissbrod AB. Liver fibrosis and inflammation. Ann Hepatol, 2003, 2: 159-163.
[6]Kersten S, Desvergne B, Wahli W. Roles of PPARs in health and disease. Nature, 2000, 405: 421-424.
[7]Nedergaard J, Petrovic N, Lindgren EM, et al. PPARgamma in the control of brown adipocyte differentiation. Biochim Biophys Acta, 2005, 1740: 293-304.
[8]Scher JU, Pillinger MH. 15d-PGJ2: the anti-inflammatory prostaglandin? Clin Immunol, 2005, 114: 100-109.
[9]Shashkin P, Dragulev B, Ley K. Macrophage differentiation to foam cells. Curr Pharm Des, 2005, 11: 3061-3072.
[10]Singh N, Webb R, Adams R, et al. The PPAR-gamma activator, Rosiglitazone, inhibits actin polymerisation in monocytes: involvement of Akt and intracellular calcium. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 333: 455-462.
《中华肝脏病杂志》版权
|
