【摘要】 目的 观察结缔组织生长因子（CTGF）反义RNA对实验性肝纤维化的影响。 方法 应用分子生物学技术构建CTGF反义RNA真核表达质粒，经腹腔注射入CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠体内；通过RT-PCR、Western blot及免疫组织化学等方法检测CTGF反义RNA基因转染前后CTGF mRNA和蛋白质在肝组织中含量的变化；并通过检测肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的变化，观察CTGF反义RNA对大鼠肝纤维化的影响。 结果 转染CTGF反义RNA后，可抑制CTGF mRNA和蛋白质的表达（P<0.01），减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积（P<0.01），并在一定程度上促进肝组织的改善（P<0.01）。 结论 CTGF反义RNA对肝纤维化有一定的治疗作用。
【关键词】 肝纤维化； 结缔组织生长因子； 反义RNA
Effects of antisense RNA of connective tissue growth factor expressing plasmid on rat liver fibrosis LU Cui-hua, LU Jing-xian, HUA Guo-ping, ZHU Jing, WANG Hua, HUANG Jie-fei, GU Mei-zhen, ZHOU Qian, NI Run-zhou. Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, China
【Abstract】 Objective To observe the effects of antisense RNA of connective tissue growth factor (CTGF) on rat liver fibrosis. Methods Gene recombinant techniques were used to construct a rat antisense RNA of CTGF recombinant plasmid which could be expressed in eukaryotic cells. The recombinant plasmids were encapsulated with lipofectamin and then transducted into a carbon tetrachloride (CCl4) induced rat liver fibrosis model. Expression of CTGF was assessed by RT-PCR, Western blot and immunohistochemistry. Immunohistochemistry was used to identify type I and III collagens. HE stained liver slides were used for pathological study. Results The mRNA and protein expression of CTGF in the fibrotic liver transfected with antisense-CTGF were significantly decreased compared with those of the controls (P < 0.01). The depositions of type I and type III collagens were also decreased (P < 0.05). Antisense-CTGF also minimized the pathological fibrosis in the rat livers (P < 0.01). Conclusion The results demonstrate that the antisense RNA of CTGF recombinant plasmid has certain effects in preventing liver fibrosis and makes it a possible candidate for use in future gene therapy.
【Key words】 Liver fibrosis; Connective tissue growth factor; Antisense RNA
肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理基础，也是进一步向肝硬化发展的中间环节。HSC的激活和增殖以及ECM的沉积是肝纤维化发生的两个重要环节。HSC是肝受损后ECM的主要来源细胞[1]。TGFβ1是目前已知最强烈的纤维化促进因子[2]。它通过与HSC膜上的受体结合后激活HSC，增加Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因转录，促进ECM合成，并抑制其降解，从而发挥在肝纤维化发生中的中心作用[3]。TGFβ1在体外实验中可以特异性诱导成纤维细胞产生结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF），并由后者作为下游介质作用于结缔组织，刺激ECM合成[4，5]。因此设法抑制CTGF表达，可望抑制HSC增殖，从而减缓肝纤维化的发生和发展。我们设计并合成能特异性定点封闭CTGF mRNA的反义RNA基因，并通过构建其表达载体，与脂质体偶联后将其导入CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型体内，观察其对实验性肝纤维化的影响。
材料与方法
1. 反义RNA的设计与合成：采用加拿大国家科学院Zuker编写的PCFold软件，对靶RNA和反义RNA进行二级结构分析，按中国科学院上海生物化学研究所陈农安教授编写的反义RNA设计软件，并结合GenBank进行分析，排除其同源性可能后，设计出针对于CTGF mRNA 222～238位碱基的反义RNA序列，两端加上T粘末端和BbsⅠ酶切位点：正义链：5′-TCCCAACCATGCTCGCCT CCGTCCACCACGGAGGCGAGCATGGTTT-3′，反义链：5′-CAAAAAACCATGCTCGCCTCC GTGGTGGACGGAGGCGAGCATGGTT-3′。 由上海生工生物工程公司合成。
2. CTGF反义RNA表达载体的构建与鉴定：CTGF反义RNA 退火并定向克隆至真核表达载体psiRNA-hH1neo（中国科学院上海生物化学研究所金由辛教授惠赠）形成psiRNA-hH1-CTGF，将其转染TG1大肠杆菌（上海第二军医大学国际肿瘤合作研究所惠赠），经卡那霉素/X-gal蓝白筛选后进行质粒抽提和扩增。将克隆结果分别进行NcoⅠ酶切鉴定和DNA测序分析，结果证实表达载体构建成功。
3. 动物模型制备与分组：雄性SD大鼠32只，体重（150±10）g (南通大学实验动物中心提供)，给予普通饲料与清水。实验动物分为4组：肝纤维化模型组：8只，采用60% CCl4（精制橄榄油配制）皮下注射法复制肝纤维化模型，用量为0.3ml每100g体重，每周2次，共6周；psiRNA-hH1-CTGF治疗组：10只，在模型制备第2周开始给予反义CTGF重组质粒，每次100μg，每2周1次，至第6周，重组质粒给予前与相应剂量的脂质体偶联后经腹腔导入体内；psiRNA-hH1neo对照组：8只，在模型制备第2周开始给予psiRNA-hH1neo空白质粒，每次100μg，每2周1次，至第6周，给予方法同上；正常对照组：6只，模型制作时以等渗盐水代替CCl4注射。实验动物于第6周末麻醉，取肝组织后处死，部分肝组织于液氮中保存备用，部分肝组织置于甲醛中，做病理检查与免疫组织化学用。
4．RT-PCR检测CTGF mRNA表达：每样本取RNA 2μg为逆转录模板，设计扩增用CTGF上游引物：5′-AGACTGGAGAAGCAGAGC-3′，下游引物：5′-ACTTCCTGGCTTTACGC-3′，预计扩增片段长度376bp（自行设计）。内参照引物（β-actin）上游引物：5′-GGCACGATATGCAGAA GAT-3′， 下游引物：5′-ATTGCCGATAGTGATG ACCT-3′，预计扩增片段长度521bp。由上海生工生物工程公司合成。反应条件：94℃ 5min；94℃退火50s，55℃变性50s，72℃延伸70s，共34个循环；72℃ 10min。反应结束后经20g/L琼脂糖凝胶电泳，采用灰度扫描经与内参照比较分析后计算CTGF mRNA的表达水平。
5．Western blot检测CTGF蛋白质表达：取60mg肝组织于1ml RIPA裂解缓冲液（1×PBS、1% NP40、 0.1%十二烷基硫酸钠、10mmol/L苯甲基磺酰氟、0.5%脱氧胆酸钠、3.6μg/ml抑肽酶、1mmol/L原钒酸钠）中匀浆，加入各样本蛋白质80μg，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏氟乙烯膜，进行Western blot分析，灰度扫描。第一抗体为兔抗大鼠CTGF抗体（稀释200倍）：第二抗体为羊抗兔IgG（稀释500倍）。
6. 肝组织中CTGF检测：采用丹麦DAKO公司Envision二步法检测系统，第一抗体为兔抗大鼠CTGF抗体（武汉博士德生物工程公司，工作浓度为1∶100），37℃ 50min，4℃过夜，DAB显色，苏木素复染。阴性对照：PBS代替第一抗体。结果采用德国LEICAQ5501W图像分析系统行半定量分析，每张切片扫描10个视野，取其吸光度值的平均值。
7．Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学：Ⅰ、Ⅲ型胶原多克隆抗体为武汉博士德生物工程公司产品（工作浓度为1∶100），采用DAKO公司Envision二步法检测系统，DAB染色，结果采用LEICAQ5501W图像分析系统测定其吸光度值代表每种成分的相对含量。
8. 病理形态学观察：对组织切片用Van Gieson染色法观察，肝纤维化病理学分级参照文献[6]。
9．统计学分析：CTGF浓度、Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学量化结果采用SPSS10.0软件做方差分析（多样本均数的两两比较）；病理形态学结果用EPI5.0软件做趋势分析卡方检验。
结 果
1. 动物情况：模型组死亡2只，其余组动物无死亡。psiRNA-hH1-CTGF治疗组动物在体重方面与psiRNA-hH1neo对照组相比，差异无统计学意义。
2．RT-PCR检测CTGF mRNA在肝组织中的含量：psiRNA-hH1-CTGF治疗组CTGF mRNA表达水平（0.97±0.11）较psiRNA-hH1neo对照组（1.47±0.12）与模型组（1.51±0.10）低（P<0.05），而psiRNA-hH1neo对照组与模型组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。正常对照组（0.25±0.07）与其他3组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。
3．Western blot检测各实验组动物CTGF蛋白质表达情况：杂交结果表明psiRNA-hH1-CTGF治疗组CTGF蛋白质表达水平明显低于psiRNA-hH1neo对照组与模型组（P<0.05），但略高于正常对照组；而psiRNA-hH1neo对照组与模型组CTGF蛋白质表达水平接近（图2）。
4．肝组织中CTGF免疫组织化学检测结果：psiRNA-hH1neo对照组与模型对照组CTGF阳性细胞明显增多，以窦内皮细胞为主，呈胞浆颗粒型，在纤维化汇管区域相对集中。psiRNA-hH1-CTGF治疗组阳性细胞数明显少于psiRNA-hH1neo对照组与模型组，而正常对照组阳性细胞少且分散。
5．肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学结果：所有实验组动物（包括psiRNA-hH1-CTGF治疗组）肝组织中I型胶原含量均显著高于正常对照组（模型组、psiRNA-hH1-CTGF治疗组、psiRNA-hH1neo对照组与正常对照组相比，q值分别为8.31、5.72和8.03，P值均<0.01）；所有实验组动物肝组织中Ⅲ型胶原也明显高于正常对照组（模型组、psiRNA-hH1-CTGF治疗组、psiRNA-hH1neo对照组与正常对照组相比，q值分别为7.54、6.72和8.12，P值均<0.01）。与psiRNA-hH1neo对照组、模型组相比，psiRNA-hH1-CTGF治疗组Ⅰ型胶原的含量显著降低（q值分别为6.54和6.78，P值均<0.01）；Ⅲ型胶原的含量也明显降低（q值分别为6.92和7.34，P值均<0.01）。
6．肝纤维化病理学分级：正常对照组与其他实验组之间的病理学分级差异有统计学意义（P<0.01）。psiRNA-hH1-CTGF治疗组与psiRNA-hH1neo对照组、模型组相比，分级情况有明显改善（P<0.01）。见表1。
讨 论
CTGF作为一种新发现的细胞生长调节因子，被认为与TGFβ1密切联系，在许多组织器官纤维化时表达水平明显增高[7，8]，而它在肝纤维化中的作用也逐渐受到关注[9]。我们也成功构建了抗CTGF反义RNA真核细胞表达载体，并将其与脂质体偶联后经腹腔导入肝纤维化模型大鼠体内，分别通过RT-PCR、Western blot以及免疫组织化学等方法证实转染CTGF反义RNA组动物肝组织中CTGF mRNA和蛋白质表达水平均较对照组明显下降，表明CTGF反义RNA基因在大鼠体内确有表达，并能在mRNA水平上封闭实验性大鼠肝脏中CTGF靶基因，从而阻断其翻译成蛋白质。
我们的实验结果还显示，转染CTGF反义RNA组大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显低于psiRNA-hH1neo对照组与纤维化模型组，表明CTGF反义RNA可显著抑制ECM沉积，对肝纤维化有显著的改善作用。但另一方面，转染CTGF反义RNA组肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量仍高于正常对照组，说明CTGF反义RNA治疗在一定时间内未能使纤维化肝脏完全恢复正常；一方面可能因为我们的疗程或观察时间不足，另一方面也可能是因为其他因素在肝纤维化的发生和发展中起重要作用，这有待于进一步的研究。但转染CTGF反义RNA组大鼠肝组织与模型组之间病理学分级存在明显差异，说明CTGF反义RNA治疗对肝纤维化仍具有较好的改善作用。
总之，本研究结果表明，CTGF在肝纤维化过程中起重要作用，封闭CTGF mRNA可阻断其蛋白质表达，从而起到抗肝纤维化作用。为了进一步提高基因治疗效果，我们正在研究HSC的靶向载体，为临床慢性肝病、肝纤维化的治疗提供新的思路。
参 考 文 献
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