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酵母双杂交筛选肝细胞中乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白基因

作者:李志群 马英骥 成军 来源: 日期:2010-5-30 17:25:15 人气:55 标签:

【摘要】  目的  筛选并克隆人肝细胞中与HBsAg中蛋白(MHBs)相互作用肝细胞蛋白的基因,探讨MHBs的生物学功能。 方法  应用PCR法以HBV adr亚型全序质粒A7为模板扩增MHBs基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBKT-7中并应用酵母双杂交系统3,构建MHBs诱饵质粒并转化酵母AH109,与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酸上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上,选择并测序结果在GenBank中进行生物信息学分析。 结果  构建MHBs酵母细胞表达载体,配合后筛选出既能在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上培养也能在铺有X-α-半乳糖苷酸的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落2个,其中一个克隆为人醛缩酶B、另一个克隆为未知功能基因,新基因命名为MBP1。 结论  扩增出MHBs基因,用酵母双杂交技术筛选出2个与MHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因, 为阐明MHBs的生物学功能及HBV损害肝细胞、致癌等方面的作用提供了新线索。
【关键词】  基因; 肝炎病毒,乙型; 酵母双杂交技术
Screening proteins in hepatocytes interacting with the middle surface protein of hepatitis B virus using the yeast-two hybrid technique   LI Zhi-qun, MA Ying-ji, CHENG Jun. Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital,Beijing 100011, China
Corresponding author: CHENG Jun
【Abstract】    Objective    To screen proteins in hepatocytes interacting with hepatitis B virus surface antigen middle protein (MHBs) with yeast-two hybrid technique for studying the biological functions of MHBs. Methods    Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the gene of MHBs from the plasmid A7 containing the whole fragment of adr subtype of HBV and the PCR product was cloned into pGEM-T vector and then evaluated by sequencing. The gene of MHBs was cut by EcoRI and BamH I from pGEM-T vector and then cloned into the yeast expression plasmid pGBKT7. MHBs bait plasmid was constructed by ligating MHBs gene with yeast expression vector pGBKT7 with yeast-two hybrid system 3 and then was transformed into yeast AH109 (a type). The transformed yeast cells were mated with yeast Y187 (α type) containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast cells were plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) and synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X-α-gal for selecting and screening. After extracting and sequencing the plasmid from true positive blue colonies, the results were analyzed by bioinformatics. Results    A pGBKT7- MHBs yeast expressed vector was successfully constructed. Two colonies were sequenced. One colony was Homo sapiens aldolase B fructose-bisphosphate, the other was a new gene with unknown function, which was named MHBs-binding protein 1. Conclusion    MHBs gene was successfully cloned. Two genes of MHBs interacting proteins in hepatocytes were obtained by yeast-two hybrid system 3. Our results brought some new clues for studying the biological functions of MHBs and the mechanisms of HBV carcinogenesis.
【Key words】     Gene;   Hepatitis B virus;   Yeast-two hybrid technique
HBV感染与肝细胞癌发生密切相关,病毒基因组编码的蛋白质与宿主肝细胞之间的相互作用,可能是病毒致癌的重要分子机制。我们应用PCR技术从我国流行株adr亚型的HBV DNA全基因序列中克隆出HBsAg中蛋白(hepatitis B virus surface antigen middle protein,MHBs)序列,通过酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,发现了一个未知功能基因,命名为HBsAg中蛋白结合蛋白1MBP1(MHBs-binding protein 1,MBP1),另一个为人醛缩酶B,果糖二磷酸盐。为进一步探讨MHBs基因结构与确切的生物学功能,及抗HBV治疗的研究提供了重要的理论和实际应用线索。
材料与方法
1.试剂与仪器:AH109酵母菌株、AH109酵母株、预转化的Y187cDNA肝文库、pGBKT7-BD克隆载体、pGADT7-AD克隆载体、pGBKT7-53对照质粒、pGBKT7-Lam对照质粒,及酵母YPD培养基、SD/-Trp、SD/-Leu,SD/-Trp/-Leu/-His,SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade等培养基、X-α-半乳糖(X-α-gal)均购于美国Clontech公司。大肠杆菌DH5α及HBV adr亚型基因全序列A7质粒为北京地坛医院传染病研究所保存。Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoRⅠ和BamHⅠ购于日本TaKaRa生物公司。丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰胺、IPTG及pGEM-T载体购于美国Promega公司。TEMED购于德国宝林曼公司。醋酸锂、半硫酸腺苷购于美国Sigma公司。肝文库插入序列扩增引物(P3:5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAAC CC-3′,P4:5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCA GTATCTACGA-3′)由上海生工生物工程公司合成,DNA测序由上海华诺公司承担。
2. PCR扩增MHBs与序列分析:上下游引物的5′端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ单一酶切位点,设计新基因的序列特异性的引物。MHBs上游引物(P1:5′-GAATTCATGCAGTGGAACTCCACCA C-3′),下游引物(P2:5′-GGATCCTCAAATGTA gTACCCAAAGAC-3′)。以含有adr亚型的HBV DNA全基因序列A7质粒,作为模板进行PCR扩增。
3.“诱饵”质粒的建立:将MHBs的PCR产物用T4连接酶连于T-载体,再用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,连接至pGBKT7载体上构成诱饵质粒pGBKT7-MHBs,用醋酸锂法[1]转染至酵母细胞AH109,并且在四缺培养基上培养排除其自身激活作用。
4. 酵母配合实验:诱饵与肝文库的酵母配合:挑取在SD/-Trp培养基上生长的pGBKT7-MHBs质粒的酵母AH109菌落(大于2mm)数个接种于SD/-Trp培养基中,30℃ 250r/min振摇过夜,次日离心后用2×YPDA培养液5ml重悬细胞,计数细胞数>1×1012个/L时与1ml的肝文库酵母细胞在30℃ 50ml 2×酵母液体培养基中30~50r/min配合18~24h,离心用1×酵母液体培养基10ml重悬细胞,分别取250ml铺于15cm的SD/-Trp/-Leu/-His三缺培养基,SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade四缺培养基各25块上,同时将配合产物按1∶10,1∶100,1∶1000铺于SD/-Trp/-Leu培养基上检验配合效率。生长6~18d后挑取大于直径3mm的菌落再次接种于铺有X-α-gal的四缺培养基上检查X-α-gal酶活性,在此培养基上能生长且变成蓝色的为真阳性菌落。 PCR扩增出文库靶基因片段后测序并进行生物信息学分析。
结    果
1. pGBKT7-MHBs重组诱饵质粒的构建及表达:利用自行设计的引物P1/P2成功扩增出MHBs基因片段,PCR产物经90g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约846bp,与预期片段符合,且无非特异扩增现象,测序结果完全符合报告序列。用EcoRⅠ及BamHⅠ双酶切所得片段,连接到用相同酶所切的pGBKT7载体中,经酶切鉴定结果正确(图1)。由此表明MHBs基因已按正确方向克隆入酵母表达载体pGBKT7中,pGBKT7-MHBs质粒构建成功。
2. 酵母配合筛选结果:既能在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落2个,用文库扩增引物PCR扩增出目的片段并测序(图2)。结果在GenBank中进行分析,发现其中1个为人醛缩酶B、果糖二磷酸盐,另一个为新基因,命名为MBP1。
3. MBP1的全长编码序列的确定:MBP1新基因的开放读码框架长度为201个核苷酸,编码产物由66个氨基酸残基组成。新基因的核苷酸序列在GenBank中注册,GenBank收录号为DQ307498,(图3)。
M N F L T G S E P E T H C G R
atg aat ttc ctg aca ggc tct gag cca gaa aca cac tgt ggg cgt
A S G S A L D M P P L W R E A
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L E L E L C T A P Q L V G L A
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L H L L S P *
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图3  MBP1的核苷酸开放读码框架及其编码蛋白序列
讨   论
HBsAg包括小蛋白(SHBs)、中蛋白(MHBs)和大蛋白(LHBs),它们都有糖基化和非糖基化两种形式。SHBs由226个氨基酸组成,是3种HBsAg相关蛋白中含量最丰富的一种。MHBs由前-S2和SHBs组成,前-S2是SHBs的N-末端延伸,长约55个氨基酸,其中心部分携带着主要的抗原表位,但与SHBs不同,其免疫表位为非构像依赖性,并且MHBs也不是病毒颗粒组装和释放所必需的。MHBs第3~16位氨基酸区域能够与多聚人血清白蛋白(pHSA)结合,这种结合的意义目前还不清楚。由于MHBs在B细胞水平的免疫原性比SHBs强,有些国家已用动物细胞系生产含前-S2的HBsAg,并已作为疫苗应用于临床[2,3]。
我们应用酵母双杂交系统3技术,在真核表达载体pGBKT7中构建pGBKT7-MHBs诱饵质粒并在酵母菌株AH109中表达了MHBs基因,与人肝cDNA文库的酵母菌株Y187进行配合,有3种报告基因分别为组氨酸、腺苷和半乳糖苷酶,加上两种载体中分别带有的亮氨酸、色氨酸,使真阳性菌落能在铺有X-α-gal并缺乏上述4种营养的培养板上生长并呈现出蓝色[4]。
我们筛选到了与MHBs相互作用的蛋白基因2种:人醛缩酶B、果糖二磷酸盐,已检测到人醛缩酶B同工酶包含14887碱基对,检测从5′到3′末端由S1编码在人、鼠、鸡醛缩酶B基因中有高度保守的核苷酸序列,在共同和特殊组织中控制这些基因的表达。可能有几个多态位点决定人类基因序列,这些基因对编码人类基因组的联接和诊断分析家族遗传性等位基因果糖不耐受性是非常有益的。肝细胞癌变后参与果糖和半乳糖代谢的特异酶类 (如果糖激酶、醛缩酶B、半乳糖激酶)等活力降低,利用果糖和半乳糖的能力减少,糖原合成减少,糖原异生作用几乎消失贻尽[5-7]。临床试验中发现,促肝细胞生长素联合果糖二磷酸钠能显著促进肝功能恢复, 提高慢性重型肝炎的疗效, 降低病死率。其作用机制可能为促肝细胞生长素刺激肝细胞DNA合成, 促进肝细胞再生。而果糖二磷酸钠作为肝细胞能量合剂, 可以保持肝细胞对缺血、缺氧的抵抗作用,两者合用可以改善肝细胞的能量代谢, 促进肝细胞在损伤过程中的修复和再生。
此外,MHBs还与1个未知功能蛋白基因有相互作用,命名为MBP1。目前MBP1基因和蛋白的结构及功能还不清楚,需要进一步的实验研究,来阐明MBP1在HBV 感染中的作用和地位。
参  考  文  献
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