【摘要】 目的 为快速、高通量检测HBV“a”决定簇热点突变，制备基因芯片，并进行了初步应用。 方法 应用HBV基因保守序列设计PCR扩增引物，针对“a”决定簇突变设计简并探针，制备了检测126A、126S、144A、145R、145E、144A＋145R和144A＋145E突变的基因芯片。通过对质粒参考品或样本进行测定，以评价芯片的特异性、灵敏度、重复性和检测劣势株的能力，并对45例乙型肝炎患者的血清样本同时应用基因芯片和PCR产物直接测序法进行检测比较。 结果 所制备的基因芯片能特异性检测出质粒参考品，灵敏度为5×103拷贝/μl。同一样本检测10次，芯片内和芯片间变异系数均小于15%。当劣势株占HBV毒株10%以上时，基因芯片即可检出。芯片法测得45例样本中126A、126S-1和126S-2的阳性率 (分别为46.67%、35.56%和24.44%) 显著高于PCR产物直接测序法（分别为9.00%、4.44%和2.22%；P值分别为0.000、0.000和0.002），克隆测序验证了基因芯片法的特异性。 结论 基因芯片法可快速、有效地检测HBV特定位点突变株，为HBV突变的大规模筛查提供了方法。
【关键词】 肝炎病毒，乙型； 基因芯片； 突变； “a”决定簇
Establishment and preliminary application of a gene chip for detection of hepatitis B virus 揳 determinant hotpoint mutation ZHANG Rui*, LI Rong-cheng, LI Yan-ping, WANG Sheng-qi, LIANG Zheng-lun, LI He-min, ZHUANG Hui. *National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China
【Abstract】 Objective To develop a gene chip for rapid detection of the 揳 determinant hotpoint mutation of hepatitis B virus (HBV). Methods Primers were designed in the HBV conservative region, and probes for detecting 126A, 126S, 144A, 145R, 145E, 144A+145R, and 144A+145E mutants were developed for that gene chip. PCR amplification and gene chip technology were optimized. The performance of the gene chip was evaluated by detecting the reference plasmids. Forty five samples of serum obtained frompatients with chronic hepatitis B were used to compare the sensitivity of the gene chip and the direct sequencing of PCR products. Results The oligonucleotide microarray was specific for mutant and native plasmids. The sensitivity of the gene chip was 5×103 copies/μl with a high reproducibility. The gene chip could detect minor variants when they were more than 10% among the HBV strains. The positive rates of 126A, 126S-1, 126S-2 detected in the 45 specimens by the gene chip (46.67%, 35.56% and 24.44%, respectively) were higher than those detected by direct sequencing of PCR products (9.00%, 4.44% and 2.22%; P = 0.000, P = 0.000 and P = 0.002, respectively). The sequencing of cloned PCR products demonstrated that the gene chip was specific for the 揳 determinant hotpoint mutation detection. Conclusion HBV 揳 determinant hotpoint mutations can be detected by oligonucleotide microarray with high sensitivity and specificity, providing a method for large scale screening of the mutants.
【Key words】 Hepatitis B virus; Gene chip; Mutation; “a” determinant
HBV是一种高度变异的DNA病毒。“a”决定簇抗原性发生改变，可能导致疫苗保护失败[1]。目前研究结果显示突变位点多数集中在S区“a”决定簇的126位、144位、145位等氨基酸位点[2]。因此，“a”决定簇突变的快速检测对于突变株流行病学监测具有重要意义。近年来，基因芯片技术以其高通量、微量化、成本低、自动化程度高等特点，在人群的筛检方面显示出强大的优势[3]。本研究中，我们制备了检测“a”决定簇突变的基因芯片，对其特性进行分析，并将芯片初步应用于乙型肝炎患者HBV“a”决定簇突变的研究。
资料与方法
一、材料
广西壮族自治区乙型肝炎患者血清由本室采集冻存，选取10例样本，选择对象标准为：HBsAg阳性、HBeAg阳性（A>3倍截断值，酶标法）；HBV DNA阳性。
二、方法
1. 引物和探针的设计与合成：根据GenBank中HBV保守序列，利用primer5.0软件设计特异性扩增HBV“a”决定簇的引物，上游引物Y1：5′-GG TTGTTGCCCGTTTGTCCTCT-3′，下游引物Y2：5′-Cy3-GGCACTAGTAAACTGAGCCA-3′。根据国内外文献，选择8种“a”决定簇常见突变作为检测对象，分别为：126位T/I突变为A［a（c/t）t突变为gct］、126位T/I突变为S［a（c/t）t突变为agt或tct，分别记作126S-1和126S-2］、144位D突变为A（gac突变为gcc）、145位G突变为R（gga突变为aga）、145位G突变为E（gga突变为gaa）、144位D和145位G突变为AR（gac gga突变为gcc aga）、144位D和145位G突变为AE（gac gga突变为gcc gaa）。由于待测突变位点两端存在正常的核苷酸变异[4]，因此，应用Primer5.0等软件分别设计针对待测突变和野生序列的简并探针（表1）。寡核苷酸采用标准亚磷酰胺化学方法在美国ABI公司的DNA自动合成仪上合成，引物Y2在合成中用Cy3亚磷酰试剂在5′端进行荧光标记，所有探针在3′端进行氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔臂（聚乙二醇磷酰化试剂）相连，合成完毕后用浓氨水55℃作用15h脱保护和切割，寡核苷酸纯化柱（OPC）反相柱纯化。
2. 样本DNA提取：采用德国Qiagen公司的QLAamp MinElute Virus Spin Kit提取HBV DNA，操作步骤按说明书进行。
3. PCR扩增：PCR反应总体积20μl，其中模板DNA 1μl，引物Y1 0.2μmol/L，引物Y2 2μmol/L，dNTP 200μmol/L，Ex-Taq DNA 聚合酶0.5U。PCR反应条件: 94℃ 5min；94℃ 20s, 54℃ 20s, 72℃ 20s，循环30次；72℃ 10min。PCR引物及Ex-Taq DNA聚合酶均购自大连宝生物工程有限公司。
4. 寡核苷酸芯片的制备：将探针用点样液稀释至终浓度50μmol/L，各取6μl转移至384孔板。用美国Cartesian Technologies公司微阵列点样仪将P1至P11探针从左至右依次点于醛基化玻片上，每个探针重复点4次，点成11×4矩阵，每点体积约为0.5nl，直径约为200μm，点样时相对湿度保持80%，温度23℃。
5. 杂交和信号检测：8μl Cy3标记的单链PCR产物与2μl杂交液混合，将10μl的混合液转移至芯片反应区。芯片置于杂交盒中，45℃水浴杂交1h。杂交后的芯片依次在洗液A（1×SSC，0.2% SDS），洗液B（0.2×SSC）和洗液C（0.1×SSC）中各洗涤1min。使用美国Axon公司激光共聚焦扫描仪在激发波长540nm，发射波长570nm（Cy3）扫描杂交芯片，产生分析精度为10μm的16位TIFF图像，在扣除背景值后，重复点的均值即为每条探针的信号强度，并用配套Genepix Pro 4.0程序对扫描结果进行分析。
6. HBV质粒参考品的构建：以本室构建并保存的HBV野生型重组质粒为模板，采用突变引物PCR扩增产生定点突变的方法，在目标片段的特定位点引入突变碱基，纯化目标片段，用T4 DNA连接酶连接至pGEM-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α并经测序确证。应用美国Beckman公司紫外分光光度计测定核酸浓度，用去离子水配制成106拷贝/μl的原始质粒参考品。以野生型和突变型质粒作为PCR标准模板,来优化芯片杂交条件及建立完全匹配与单碱基错配的探针间信号强度的比值。
7. 灵敏度检测：将原始质粒参考品稀释成不同浓度，各取1μl进行PCR、杂交、信号检测，以确定芯片的灵敏度。
8. 重复性检测：选取10例样本，从片内检测差异、片间检测差异、同一样本检测10次三方面进行重复性实验。
9. HBV劣势株的检测：将126S-1质粒参考品与野生型参考品分别按比例混合，使126S-1参考品分别占参考品混合液的0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。取各个参考品混合液1μl进行PCR、杂交、信号检测，以确定芯片检测HBV劣势株的能力。
10. DNA测序：对45例样本的PCR产物直接进行DNA测序，并挑选5例样本进行克隆，每例样本挑选10个阳性克隆进行测序，测序由北京华大基因有限公司进行。
三、统计学分析
采用SPSS11.0进行统计分析，应用χ2检验。
结 果
1. 杂交信号判断标准的确定：在优化的杂交条件与洗脱条件下，按照野生型与突变型质粒参考品的杂交结果，完全匹配的探针与单碱基错配的探针杂交信号强度之间存在明显的差异，匹配与错配探针信号强度比值在2以上，当匹配与错配探针信号强度比值小于2时，则检测结果为混合感染。
2. 特异性检测结果：126A、126S-1、126S-2、144A、145R、145E、144A+145R、144A+145E 8种突变型参考品和野生型参考品的PCR扩增产物进行芯片杂交，结果显示芯片能够特异的检测出“a”决定簇热点突变参考品和野生型参考品，见图1。
3. 灵敏度检测结果：对不同稀释度的质粒参考品检测，结果显示芯片可检测出浓度为5×103拷贝/μl的参考品，见图2。
4. 重复性检测结果：片内检测差异、片间检测差异、同一样本检测10次三方面重复性实验结果的变异系数均小于15%。
5. 劣势株检测结果：随着突变株比例的增加，特异性检测126S-1的P3探针的信号逐渐增强，特异性检测126T/I的P1探针的信号逐渐降低。当126S-1参考品在参考品混合液中所占的比例大于10%时，其突变检测探针杂交信号值与相应野生序列探针杂交信号值的比值大于0.5，按杂交标准判断为混合感染，亦即当劣势株>10%，芯片即可检测出，见图3。
6. 临床样本检测结果：45例样本中，芯片法测得126A、126S-1和126S-2的阳性率分别为46.7%、35.6%和24.4%，PCR产物直接测序法分别为9.0%、4.4%和2.2%，P值分别为0.000、0.000和0.002，差异有统计学意义，见表2。为验证该2种方法检测的结果，选择5例样本进行克隆测序，芯片均可检出特定位点的突变株，而PCR产物直接测序仅检出优势株（>50%）；其中1例样本克隆测序检出1例144A，并发现在144位点后插入一个核苷酸（C），而芯片检测和PCR产物直接测序均未检出。
讨 论
有效测定HBV“a”决定簇突变、监测人群中突变株感染流行趋势具有重要的现实意义[5]。但是HBV的突变频率较高，野生株和突变株病毒常共存于HBV感染人群中，并且突变株多为弱势株，用目前常用的PCR产物直接测序法很难检测到[6]，并且该法繁琐费时、费用昂贵，不适于大规模样本的筛检。本研究采用设计并制备的HBV“a” 决定簇热点突变检测基因芯片可同时对多个样本测定多种“a”决定簇突变，从而实现了对HBV“a” 决定簇热点突变高通量、并行性检测。
在单碱基突变检测中，检测探针的设计与优化，是芯片检测方法的关键。本研究制备的HBV“a” 决定簇热点突变检测基因芯片包括8种常见点突变及2种野生序列的检测探针。由于待测突变位点两端存在正常的核苷酸变异，因此设计了简并探针，根据待测突变位点两端存在正常的核苷酸突变情况[4]，首次将简并探针引入芯片的设计中，经过反复实验优选和严格控制杂交条件，发现完全配对与错配探针之间的信号比值均大于2，根据杂交图像的判定标准可对它们进行有效的区别，同时简并探针还具有简单、利于优化条件、节约成本等优点。用已构建的HBV突变型和野生型质粒参考品对芯片检测的特异性进行考察，结果显示芯片可以特异地同时检测HBV“a”决定簇的多个点突变，当劣势株占HBV毒株10%以上时芯片即可检出，灵敏度可达5×103拷贝/μl。
本实验选取10例阳性样本对基因芯片进行重复性实验，变异系数均小于15%，表明该芯片重复性较好。本研究应用PCR产物直接测序法和基因芯片法同时检测45例HBV样本，比较两种方法的优劣并应用克隆测序法对它们进行验证。克隆测序证实，除有1个克隆由于144A后插入一个核苷酸影响芯片检出外，其余特定位点的突变株均能通过芯片检出，但这也是基因芯片单碱基突变位点检测高特异的一个佐证。而PCR产物直接测序法只能检测出优势株。这表明本研究建立的芯片技术在检测突变株方面优于目前常用的PCR产物直接测序法。基因芯片法可一次性检测多个突变位点，同时还具有耗时少、费用低、简单方便等优点，适于大规模人群的筛查，这是克隆测序法和PCR产物直接测序法所无法比拟的[7]。
本研究中建立的基因芯片为HBV“a”决定簇突变检测提供了一种新型的检测手段，从而为对特定位点突变株进行流行病学监测、探讨现有疫苗与突变株的关系提供了基础。
参 考 文 献
[1]Cooreman MP, van Roosmalen MH, te Morsche R, et al. Characterization of the reactivity pattern of murine monoclonal antibodies against wild-type hepatitis B surface antigen to G145R and other naturally occurring 揳 loop escape mutations. Hepatology, 1999, 30: 1287-1292.
[2]Hsu HY, Chang MH, Ni YH, et al. Surface gene mutants of hepatitis B virus in infants who develop acute or chronic infections despite immunoprophylaxis. Hepatology, 1997, 26: 786-791.
[3]Venkatasubbarao S. Microarrays--status and prospects. Trends Biotechnol, 2004, 22: 630-637.
[4]Wang YC, Lin JX, Zhang HY, et al. Study on hepatitis B virus s gene mutant. Zhongguo Shengwuzhipinxue Zazhi, 2000, 13: 65-67.
王佑春,林京香,张华远,等．乙型肝炎病毒S基因变异株的研究．中国生物制品学杂志,2000,13:65-67．
[5]Zuckerman JN, Zuckerman AJ. Mutations of the surface protein of hepatitis B virus. Antiviral Res, 2003, 60: 75-78.
[6]Ngui SL,O扖ounell S, Eglin RP, et al. Low detection rate and maternal provenance of hepatitis B virus S gene mutants in cases of failed postnatal immunoprophylaxis in England and Wales. J Infect Dis, 1997, 176: 1360-1365.
[7]Li JH, Chen B. Gene chip and its use in the detection of mutations. Yixue Yanjiusheng Xuebao, 2005, 18: 54-58.
李金恒，陈冰．基因芯片及其在突变检测中的应用．医学研究生学报,2005,18:54-58.
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