【摘要】 目的 研制国内用于HBV DNA扩增检测的血清标准物质。 方法 用HBV DNA阴性血浆将阳性血浆稀释至含量约1.00×106拷贝/ml，0.5ml/支分装，然后进行真空冷冻干燥。检测方法采用实时荧光定量PCR方法和罗氏公司的PCR内标定量方法。检测室温14d、37℃ 7d、2～8℃ 6个月和-20℃时制备物的HBV DNA含量变化，确定其在不同条件下的稳定性。2年内不定期检测8次-20℃和-70℃保存时制备物的HBV DNA含量变化，确定其长期保存的稳定性。取30份样本分别检测其HBV DNA含量，并与混合后样本的HBV DNA含量进行比较，确定制备物的均匀性。制备标准品的HBV DNA含量通过与国际标准物质比对及根据国际标准物与制备标准物的吸光度值建立的标准曲线计算获得。 结果 该标准物质HBV DNA定值为（1.03±0.21）×106U/ml。稳定性实验表明制备物在室温、37℃和2～8℃时的HBV DNA含量与对照组（-20℃）比较，差异无统计学意义（t值分别为0.152、0.949、1.300，P值均＞0.05）；-20℃保存2年的制备物HBV DNA含量与对照组（-70℃）比较，差异无统计学意义（t＝0.449，P>0.05）。均一性检测结果表明瓶间不精密度为4.46%，批内精密度和总精密度差异无统计学意义（F＝1.0250，P>0.05）。 结论 该制备物达到了国家一级标准物质的要求，可以作为用于核酸扩增检测的HBV DNA标准物质。
【关键词】 肝炎病毒，乙型； DNA； 标准物质
Establishment of the first national standards for nucleic acid amplification technology assay for HBV DNA WANG Lu-nan, DENG Wei, SHEN Zi-yu, CHEN Wen-xiang, LI Jin-ming. National Center for Clinical Laboratory, Beijing 100730, China
Corresponding author: LI Jin-ming
【Abstract】 Objective To establish a Chinese national standard for a nucleic acid test (NAT) for HBV DNA. Methods The candidate sample of HBV DNA positive plasma was diluted with HBV-negative human plasma. The sample was lyophilised with a concentration of approximately 300 000 copies/ml. The measurement methods used included Roche Amplicor assay (version 2.0) and real-time PCR. The lyophilised preparation was calibrated by the international standard (NIBSC code: 97/746) from NIBSC. Results The quantity of this lyophilised preparation was (1.29±0.24)×105 IU/ml in comparison with the international standard for HBV DNA 97/746. The stability test indicated that the sample was stable at room temperature (20-25℃) for 2 weeks and at 37℃ for at least 1 week. Long-term stability was observed at 2-8℃ for 6 months and at -20℃ for more than 2 years with no significant changes. The vial-to-vial imprecision rate was 3.53%. Conclusion Based on the results of this study, our lyophilized sample can be used as a standard in China for the nucleic acid test (NAT) for HBV DNA.
【Key words】 Hepatitis B virus; DNA; Standards
20世纪80年代中期以来，以核酸扩增为基础的分子诊断技术发展很快，在医学领域已应用到微生物学、遗传学、法医学等多个学科，并正在成为临床实验室的重要检测方法之一。乙型肝炎作为国内一种最为常见的感染性疾病，抗病毒治疗是其常用的治疗方法。为检测抗病毒治疗的有效性，需要定量检测患者血清（浆）中的HBV DNA，可以使用的定量检测方法有PCR、支链DNA（bDNA）和线性信号扩增（SLA）等，国内使用最普遍的是PCR技术，且以实时荧光定量PCR技术为主。但由于国内没有统一的标准，各试剂盒采用的工作标准不一致，同一工作标准也不能将提取效率等因素考虑进去，造成同一份样本不同试剂不同人员操作结果相差10倍乃至100倍，给临床诊断和治疗监测带来一定混乱。要解决HBV DNA临床定量检测的标准化问题，首先需要统一的标准物质。针对国内缺乏HBV DNA标准物质这一现状，卫生部临床检验中心参考世界卫生组织（WHO）相关项目标准物质的研制方法，研制了HBV DNA标准物质，由于采用定值血清作为标准进行定量，消除了不同试剂不同人员操作间的差异，又有溯源性，使不同试剂的检测结果具有了可比性，该标准物质［编号：GBW(E)090031］的应用将有力地促进临床HBV DNA定量检测的标准化。
资料与方法
一、标准物质的制备
1．原料筛选：（1）阳性血浆的筛选：筛选一份HBV DNA阳性血浆，约100ml，用荧光定量PCR检测试剂进行初步定值，并且检测其抗-HCV、抗-HIV，确定其均为阴性。（2）稀释用阴性血浆的筛选：筛选20份HBV血清学标志物（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）、抗-HCV、抗-HIV均为阴性的献血员血浆，将该冰冻血浆在4℃复融后，去除沉淀，混合均匀，用于阳性血浆的稀释。
2．制备：用阴性血浆将阳性血浆稀释至HBV DNA含量约1.00×106拷贝/ml，总量约为2000ml。分装液体制备物，分装量为每支0.5ml，真空干燥。
二、仪器和试剂
仪器为罗氏公司的COBAS Amplicor核酸扩增检测全自动系统和ABI 5700荧光定量PCR仪。试剂：ROCHE HBM检测试剂，内标定量方法，批号B0119；HBV DNA荧光定量PCR试剂盒，洛阳华美生物工程公司，批号20020601。WHO国际标准品：NIBSC，编号 97/746，含量5×105U/支（每支0.5 ml）。
三、检测
1．稳定性试验：抽取冻存血清样本，按以下放置样本条件放置，每种条件放置5支。放置条件：（1）室温（20～25℃），相对湿度20%～50%，14d；（2）37℃，相对湿度60%～80%，7d；（3）冰箱冷藏（2～8℃），6个月；（4）-20℃（不同条件下稳定性对照组）。在不同时间随机抽取-20℃冻存的样本，每次抽取2支，分别用灭菌双蒸水复溶，每支加0.5ml，室温放置15min，漩涡振荡混匀。用HBV DNA荧光定量PCR试剂盒检测，其中每份样本从核酸提取开始平行做2份。以-70℃冻存的样本作为长期保存稳定性对照组，与-20℃保存时的检测值作比较，监测制备物长期保存时HBV DNA的含量变化。
2．均匀性检测：任意抽取30支样本，用0.5ml灭菌双蒸水复溶混匀后，进行编号。从每支复溶样本中取200μl，共6ml充分混匀，用于批内不精密度的检测，共检测30次。1～30号样本分别进行检测，每份样本检测1次，计算测定（总）不精密度。该检测为同一人操作，1次上机完成。
3．定值的检测：采用ROCHE的检测方法与国际标准比对定值。按试剂说明书要求提取样本，每个稀释度均做双份取平均值。将国际标准品与待测物进行同等比例稀释，将国际标准品含量与对应的吸光度值（A）国际标准/A内对照作标准曲线。根据标准曲线及HBV DNA国际标准含量为5×105U/支，包装量为0.5ml，求出制备物的HBV DNA含量。
四、统计学处理
稳定性试验采用t检验，均匀性检测采用方差齐性检验，定值检测采用待测物与国际标准物质进行多点相关分析的方法。
结 果
1．稳定性实验结果：（1）不同条件下放置制备物结果：室温、37℃和2～8℃时的制备物HBV DNA平均含量分别为（2.05±0.35）×106拷贝/ml、（2.23±0.35）×106拷贝/ml和（2.29±0.48）×106拷贝/ml，与对照组（-20℃）时的（1.98±0.18）×106拷贝/ml比较，差异无统计学意义（t值分别为0.152、0.949、1.300，P值均＞0.05）。（2）对制备物的稳定性进行长期监测，对照组HBV DNA平均含量为（2.40±0.57）×106拷贝/ml，定值制备物为（2.36±0.53）×106拷贝/ml。2年间共不定期对制备物监测8次（表1），定值制备物组与对照组（-70℃）间差异无统计学意义（t＝0.449，P>0.05），表明该定值制备物长期保存含量无明显变化。
2．制备物的均匀性检测：对混合样本检测30次的数据和30份样本（瓶间差异为4.46%）的检测数据进行统计，样本中制备物HBV DNA含量分别为（2.37±0.77）×106拷贝/ml和（2.38±0.78）×106拷贝/ml，瓶间变异率分别为32.61%和32.88%。将两组数据作方差齐性检验，批内精密度和总精密度差异无统计学意义（F＝1.0250，P>0.05），符合均匀性要求（国家一级标准物质对均匀性的要求取决于使用要求）。
3．制备物靶值的确定：不同稀释比例WHO标准品与制备标准物检测数据见表2，二者相关系数为0.992，检测值差异无统计学意义（t＝1.622，P＞0.05），确定该制备物含量约为1×106U/ml。由于国际标准品的HBV DNA含量与待测物接近，因此将国际标准品HBV DNA含量与对应的A国际标准/A内对照作标准曲线，然后求出待测物的HBV DNA含量。标准曲线为：Y＝－1693.07＋1460.51X，r＝0.9975。经计算定值制备物HBV DNA含量为1.03×106U/ml。样本定值的总不确定度计算包括分析测定误差、样本复溶及稀释过程误差和样本不均匀性引起的误差。经计算，该制备物HBV DNA的定值总不确定度为0.21×106U/ml。因此，该标准物质HBV DNA定值为（1.03±0.21）×106U/ml。
讨 论
HBV DNA的定量检测方法中，国内使用最早且最为普遍的是PCR技术，目前基本上采用实时荧光定量PCR技术。荧光定量PCR技术的检测过程中是扩增和检测同时进行的，因此主要包括几个步骤：核酸提取、扩增检测、结果分析。
早些时候检测HBV DNA 和HBV DNA的核酸扩增方法灵敏度和特异性差别很大，同时核酸扩增检测结果报告的单位有很多种，如genome equivalent/ml、拷贝/ml和PCR检测单位/ml等等，不同实验室之间结果很难进行比较。为了解决这个问题，WHO于1997年组织多中心合作研制了用于病毒核酸扩增检测的HBV DNA国际标准品[1，2]，单位为U/ml。该标准物质已在多个机构和实验室得到极为广泛的应用，包括制备相应的工作标准[3]、评价HBV DNA定量检测方法[4-6]、针对乙型肝炎不同基因型适用性的研究[7，8]、血液制品的核酸筛查以及研制相应的国家标准等[9-11]。HBV DNA是我国开展最为普遍的临床基因扩增项目，但由于缺乏统一的标准，结果之间没有可比性。针对存在的问题，卫生部临床检测中心已做了大量的研究工作，包括HBV DNA血清稳定性的研究、冻干血清用于室间质量评价的研究及试剂的工作标准等[12,13]。本研究参照国际标准品的制备方法，含量的确定采用国际公认的核酸扩增内标定量的罗氏COBAS Amplicor仪器和配套试剂与国际标准多点比对的方法。所制备的标准物质，在国内主要PCR检测试剂的生产厂家均得到了应用[14]，在稳定性及定值的准确性方面得到充分肯定。另外，从该标准物质传递的室间质评物已在全国使用，对临床实验室检测结果的准确性起到了良好的促进作用[12，13]。由该制备物传递的以血清为基质的定值血清标准曲线，由于采用定值血清作为标准进行定量，消除了不同试剂不同人员操作间的差异，又有溯源性，使不同试剂的检测结果具有了可比性[14]。
我国的标准物质管理法规[15]规定定值结果一般表示为标准值±总不确定度。要明确指出总不确定度的含义并指明所选择的置信水平。当构成总不确定度的第二部分和第三部分影响可以忽略时，定值结果也可用如下信息表示：标准值、标准偏差和测定数目。本研究中标准值的不确定度由以下几部分组成：（1）定值方法的不确定度；（2）定值检测中一些影响因素，例如加样；（3）不均匀性引起的误差，即制备物的瓶间差异；（4）稳定性（2年的监测结果）变化引起的误差；（5）本研究中我们采用的定值比对物为NIBSC标准品，其量值未给出不确定度，因此在计算定值检测的不确定度时不考虑参比标准品的不确定度。
HBV DNA的国际标准品（NIBSC编号97/746），采用HBV阴性人血浆稀释，同时该稀释血浆的抗-HIV、抗-HCV、HCV RNA、HIV RNA和细小病毒B19均为阴性。该标准物质分装量为0.5ml，冻干后-20℃保存。我们参照国际标准物质的制备方法，含量采用与国际标准物质比对得到。研制的HBV DNA定值制备物与WHO的国际标准相比，其包装量和性状（冻干品）均一致。在稳定性方面，分别作了室温（20～25℃，相对湿度20%～50%）14d、37℃（相对湿度60%～80%）7d、冰箱冷藏（2～8℃）6个月及-20℃保存2年的含量变化监测，其结果与对照样本（-70℃冻存样本）差异均无统计学意义，表明均达到国际标准要求[2]。均一性检测结果表明瓶间不精密度为4.46%，且批内精密度和总精密度差异无统计学意义，达到了国家一级标准物质的要求[15]。由于该定值制备物基质为冻干血清，含有完整的病毒核酸序列，与临床检测的患者标本一致，具有很好的临床适用性。
该定值制备物是我国第一个可溯源到国际标准的用于核酸检测的标准品，其应用包括：（1）将该标准物质用于各试剂厂家HBV DNA的定标；（2）依据该标准品制备标准系列血清用作厂家试剂的工作标准；（3）向全国提供可溯源到该标准物质的室内质控品，用于HBV DNA的日常检测。
在国际上，发达国家的试剂厂家均采用可溯源到国际标准的标准系列来进行定量检测，而我国的试剂生产厂家标准来源、定量单位均不统一，造成检测结果存在10倍乃至100倍的差异，该标准物质的应用势必改变目前国内HBV DNA定量检测缺乏统一标准、结果没有可比性的现状，是我国核酸检测标准化迈向世界的第一步。
参 考 文 献
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