【摘要】目的采用普通型中空纤维及编织型中空纤维两种人工肝生物反应器，比较其内培养的肝细胞生存时间及功能，为生物反应器的设计提供新的方法和思路。方法将新生中国实验小型猪的肝细胞与微载体共同培养，待肝细胞与微载体充分粘附形成微载体球形聚集体后，将其注入生物反应器的外腔，在培养液内加入氯化氨、醋胺酚检测生物反应器的生物转化和代谢功能，行无血清培养检测肝细胞白蛋白的合成功能，并检测肝细胞酶的漏出量。锥虫蓝染色测定肝细胞的活力，透射电镜观察其超微结构。结果肝细胞与微载体相互聚集，形成了具有一定结构层次的肝细胞聚集体，重构了肝细胞之间的相互连接；接种入生物反应器后，在编织型生物反应器中肝细胞1周内保持较高的活力，至第7天肝细胞活力仍高达(75±6.3)%，对醋氨酚和氯化铵有良好的代谢、生物转化功能，白蛋白合成在第7天为(0.57±0.13) mg/106个肝细胞，酶的漏出量也少，各项指标均明显优于普通型生物反应器组(P<0.05)。结论编织型生物反应器为肝细胞的生长、增殖提供一个类似体内的三维立体环境，是一种性能良好的生物反应器。 【关键词】人工肝； 生物反应器； 肝细胞； 微载体； 组织化培养 A comparison study of piglet hepatocyte culture in two types of artificial liver bioreactorHE Lirong, WANG Yingjie, DAI Kunyang, et al.Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of JiangXi Traditional Medical College, NanChang 330006, China 【Abstract】ObjectiveTo provide some new ideas and means for designing bioreactor by comparing two types of artificial liver bioreactor. MethodsMicrocarrier culture of piglet hepatocytes was performed in the culture bottle, after formation of microcarrierspheroided aggregates the hepatocytes were seeded into extralumen of the bioreactor and cultured with a artificial capillary cell culture system. Then NH4CL and Acetaminophen were added in the culture medium, the biological transforming function of the bioreactor was examined. The synthetic function of albumin of hepatocytes was tested, and the enzyme release of hepatocytes was examined. Viability of hepatocytes by both the trypan blue exclusion test and the ultrastructure of hepatocytes were determined. ResultsHepatocytes which formed microcarrierspheroided aggregates had some cell structures and reconstructed the cellcell connections. Hepatocytes in the woven bioreactor maintained high viability within one week(viability of hepatocytes reached 75%±6.3% at 7 d). The biotransformating function both for NH4CL and Acetaminophen and synthetic function of albumin of hepatocytes were well maintained (0.57±0.13 mg/106 hepatocytes at 7 d), only a little of AST and LDH released from the cultured hepatocytes within one week. All these were much better than the common bioreactor(P<0.05).ConclusionHepatocyteorganoids having a tissuelike structure were equaly distributed into the extralumen of woven bioreactor under the support of woven hollow fiber which provide a three dimensions environment similar to that in vivo for growth and proliferation of hepatocytes. So it is a type of good performance bioreactor. 【Key words】Artificial liver; Bioreactor; Hepatocytes; Microcarrier; Organoid culture 生物人工肝（bioartificial liver,BAL）发展至今已有40余年。临床试验证明，BAL能促进肝功能衰竭患者的恢复，或者过渡到肝移植［1,2］。生物反应器是BAL的核心部件，对其设计的主要目的是既保持肝细胞活力和功能，又不妨碍肝细胞的营养及代谢产物的交换，同时还能起到治疗的作用。我们在传统的普通型中空纤维生物反应器的基础上，研制出一种新型的编织型中空纤维生物反应器，并已证明其有良好的物质传输功能［3］。本实验通过编织型生物反应器与普通型生物反应器的对比研究，进一步评价其性能。 材料与方法 一、材料 (一) 动物及主要试剂新生中国实验小型猪，由第三军医大学动物中心提供，雌雄不限。Ⅳ型胶原酶、酶抑制剂、HEPES、Cytodex3微载体、PloyHEMA、DMEM、L谷氨酰胺、氨离子检测试剂盒和醋氨酚检测试剂盒等试剂均由Sigma公司提供。 二、方法 (一) 实验分组分成普通型生物反应器组（瑞典Fresenius公司）和编织型生物反应器组（自行研制）。 (二) 肝细胞分离用体外两步胶原酶消化法进行消化［4］，在此基础上稍作改良，过程简述如下：腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）将乳猪麻醉，无菌条件下取肝(取肝前自门静脉注入肝素钠100～150 U)，置自制的体外灌流装置进行整肝两步循环灌流消化［5］。灌流结束后，将其放入DMEM培养液中，钝性撕开肝包膜和剔除肝纤维结缔组织，收集细胞悬液，低速离心（50 g×3 min×3次）。锥虫蓝拒染法判断肝细胞活率。 (三) 肝细胞的组织化培养按0.8g/109细胞比例称取Cytodex3微载体，用PBS清洗3次，15磅30 min灭菌, 用含10%小牛血清的DMEM浸泡过夜备用。按0.8g/109细胞比例将含2～4×109个肝细胞的悬液（浓度为3×107/ml左右）和微载体加入被覆PloyHEMA的大型培养瓶中，用吸管轻轻打匀, 将培养瓶置于细胞培养箱中的电控水平摇床，摇床的速度为50～60 r/min，用自然沉降法更换培养基，4～6 h后将肝细胞分瓶，使肝细胞的密度降为7～9×106/ml左右，并按上面速度持续转动摇床，根据肝细胞的生长及培养液的颜色更换培养液。 (四) 生物反应器的构建和制备普通型生物反应器的外形为圆柱状，其内中空纤维管成平行束状排列，共两个腔室即纤维内腔和纤维外腔。编织型生物反应器是将中空纤维管相互交叉编织成三维立体结构，其间用数层100目的尼龙膜相隔，共同对肝细胞的立体培养起支撑作用。生物反应器由中空纤维管分隔为3个腔室，外腔为中空纤维管与外壳之间的腔室，用于肝细胞培养。相互交叉的纤维分别构成两个独立的内腔，用于培养液/血浆/氧气的循环。普通型生物反应器和编织型生物反应器使用前经PBS反复冲洗，并用含有10%小牛血清的DMEM浸泡过夜备用。将培养好的肝细胞微载体球形聚集体缓慢注入生物反应器外腔，然后与人工毛细管培养液循环装置相连接，循环装置中包括氧气/二氧化碳弥散管道、培养液贮池、Cellmax循环泵和生物反应器。贮液池中加入DMEM培养液，将整个装置置于细胞培养箱中，以30ml/min的速度循环培养液，并于注入反应器前后第3、5、7天从反应器内取出肝细胞在倒置相差显微镜和透射电镜下观察肝细胞的形态和超微结构。 (五) 反应器的功能检测每天向培养液中加入氯化氨（浓度为4 mmol/L）和醋氨酚（浓度为50 μg/ml），12 h后换去培养液并取标本作生化分析，第3、5、7天行无血清培养。用全自动生化分析仪（东芝7020）检测培养液中氨离子的浓度、LDH、AST的漏出量及培养液中白蛋白的含量，用荧光偏振免疫分析仪（美国Abbott公司）测定培养液中醋氨酚的浓度。 (六) 反应器内肝细胞活力、形态及超微结构的观察于注入反应器前后的第3、5、7天从反应器取出肝细胞，部分用胰酶消化成单个细胞，用锥虫蓝拒染法测定肝细胞的活率。在透射电镜下观察其他肝细胞的形态和细胞内的超微结构。 三、统计学处理 结果以均值±标准差（±s）表示，实验结果均采用t检验。 结果 一、肝细胞的产量及活率 本实验采用改良的体外两步消化酶灌流法分离肝细胞，平均每g肝组织可获得(8.57±0.59)×107个肝细胞，锥虫蓝拒染法判断肝细胞活率在(95±3.7)%，分离完成时大多数肝细胞集结成聚集状，普通培养显示肝细胞有良好的分裂增殖能力。 二、肝细胞聚集体的形成及特征 在倒置相差显微镜下动态观察肝细胞的粘附与聚集情况。1 h后少量肝细胞粘附在微载体上，而肝细胞之间的聚集却明显增多，4 h后微载体上粘附的肝细胞明显增多，且多数是肝细胞的聚集体，肝细胞聚集体通过微载体连接成较大的片状结构（见图1A）。12 h后，大多数肝细胞与微载体形成了大片状的微载体球形聚集体（见图1B）。透射电镜显示，肝细胞之间聚集成团块状，并与微载体紧密相连，细胞之间见大量的绒毛状结构，绒毛相互穿插形成胆小管，肝细胞间见桥粒状紧密连接。 三、反应器内培养的肝细胞活力及超微结构 第3天普通型生物反应器内的肝细胞活力已明显下降，部分肝细胞聚集体开始解体，锥虫蓝拒染法测定为(70±8.6)%，第7天绝大部分肝细胞聚集体解体，细胞活力仅为(50±12.7)%，而第3天编织型生物反应器内的肝细胞与刚接种时无明显改变，球形的肝细胞聚集体紧紧地粘附在微载体上，肝细胞活率为(90±4.3)%，第7天时有少部分肝细胞聚集体开始解体，肝细胞活率有所下降，为(75±6.3)%。透射电镜显示，普通型生物反应器内的肝细胞于第3天便可见线粒体明显水肿，部分细胞出现细胞器外溢；编织型生物反应器内的肝细胞至第7天仍可见桥粒状紧密连接及胆小管样结构。图1（略）图2（略）。 四、生物反应器的代谢及合成功能检测 编织型生物反应器对醋氨酚代谢和氯化铵的转化作用明显优于普通型生物反应器组（见表1、表2），且编织型生物反应器白蛋白的合成至第7天仍达(0.57±0.13) mg/106个肝细胞。 表1（略）表2（略） 五、反应器内肝细胞酶的漏出量测定 普通型反应器内肝细胞LDH、AST漏出量随培养时间的延长而升高；编织型生物反应器内肝细胞LDH、AST漏出量开始几天升高不明显，第5天后开始稍有升高。 讨论 近年来，生物人工肝发展迅速，在肝细胞体外培养和生物反应器设计两个方面取得了较大进展。到目前为止，已设计出多种类型生物反应器，其中中空纤维型生物反应器是用于实验和临床治疗最广泛的生物反应器［6］。 本实验采用普通型生物反应器和自行设计的编织型中空纤维生物反应器进行对比实验研究，并将培养好的肝细胞注入生物反应器外腔。实验结果表明，普通型生物反应器的纤维成平形束状排列，培养好的肝细胞微载体球形聚集体注入其外腔后，肝细胞聚集体易于在生物反应器底部沉积，肝细胞的堆积造成了肝细胞缺乏营养物质及氧气，致使肝细胞死亡及肝细胞聚集体解体，因而反应器内的肝细胞随着培养时间的延长，其功能明显下降，细胞形态和超微结构也均出现较大的退变。而在编织型生物反应器内，肝细胞聚集体在相互交叉编织的纤维支架和尼龙膜的支撑下不易在其底部沉积；其次相互交叉的纤维管类似于肝组织内的毛细管道系统，而微载体球形聚集体就类似于肝小叶结构，培养好的组织样结构的肝细胞聚集体注入反应器内，经过纤维内腔的培养液将营养提供给肝细胞，又将其产生的代谢产物带走。本实验在仅有硅胶管弥散供氧的条件下，编织型生物反应器内的肝细胞能在1周内保持良好的活力和功能，培养至第7天，反应器肝细胞活力仍高达70%左右，白蛋白的合成也达到0.57 mg/106个肝细胞。本实验所用的编织型生物反应器是初步模仿肝脏内部结构而设计的。实验证明，此生物反应器能为其内培养的肝细胞提供一个类似于体内的三维立体环境。在这种环境下肝细胞形成的聚集体，几乎都能与灌流液相接触，并能形成类似于正常肝脏的低弥散梯度，因此有利于肝细胞的生长和维持肝细胞的表型，并能良好地保持肝细胞的功能。 此外，作为BAL系统中的核心部件，生物反应器至少能容纳15×1010个肝细胞（约为正常肝脏的10%）才能对肝病患者起到支持作用。因此，生物反应器的易于放大对BAL的发展也具有重要的意义。目前，普通中空纤维型生物反应器培养的肝细胞数量有限，而本实验采用的编织型三维立体中空纤维反应器，不仅中空纤维数量多、体积大、肝细胞附着面积广，而且可根据临床运用情况进一步扩大。但是，中空纤维管对肝细胞的粘附仍然是一个尚未解决的问题，在我们的研究中也发现，在没有被覆胶原或其他基质的情况下，肝细胞不易粘附在中空纤维管的外壁上，这就使肝细胞聚集体容易发生堆集，促进肝细胞死亡。所以，研制出性能更好的生物反应器及如何长时间地保持生物反应器内肝细胞的活力和功能还有待于进一步探索。 参考文献 1Rozga J, Podesta L, Lepage E, et al. A bioartificial liver to treat severe acute liver failure. Ann Surg, 1994, 219∶538-546. 2Watanabe FD, Mullon CJP, Hewitt WR, et al. Clinical experience with a bioartificial liver in the treatment of severe liver failure: A phase I clinical trial. Ann Surg, 1997, 225∶484-494. 3王英杰, 郭海涛, 刘鸿凌，等. 新型中空纤维编织型生物人工肝反应器的初步构建. 第三军医大学学报, 2003, 25∶469-471. 4王英杰, 刘国栋, 刘 俊, 等. 大量分离乳猪肝细胞的方法. 世界华人消化杂志, 1999, 7∶661-662. 5郭海涛, 王英杰, 刘 俊, 等. 体外灌流装置分离肝细胞的初步探索. 第三军医大学学报, 2003, 25∶549-550. 6Legallais C, David B, Dore E. Bioartificial liver(BAL): current technological aspects and future developments. J Med Sci, 2001, 181∶81-95. 《肝脏》杂志社版权 |