【摘要】 目的 借助DC的强大抗原呈递能力，使其负载HBsAg后以激活HBsAg特异性的CTL，从而探索一种可有效活化机体抗HBV细胞免疫的免疫方式。 方法 从健康产妇分娩的胎儿脐血中分离出单个核细胞，在细胞因子组合的作用下诱导出DC，于体外负载HBsAg后，激活自体T细胞成CTL，于体外培养环境下检测其对表达HBsAg的靶细胞HepG2-S的杀伤效应。 结果 人脐血来源的单个核细胞可在多种细胞因子的作用下，被诱导为DC。DC在负载HBsAg后可于体外活化HBsAg特异性的CTL。效应细胞为负载HBsAg的DC活化脐血单个核细胞，靶细胞分别为不表达和表达HBsAg的HepG2，当效应细胞和靶细胞比为1∶1时出现最大的杀伤效率，CTL对靶细胞的杀伤率分别为（16.36±6.42）%和（78.09±9.66）%，差别有统计学意义（P<0.01）。 结论 健康人脐血来源的DC，具有较强的抗原呈递功能，可在体外激活产生HBsAg特异性CTL，在表达HBsAg的靶细胞模型上可观察到一定杀伤效果，为人脐血来源DC用于抗HBV治疗进行了有益的探索。
【关键词】 肝炎病毒，乙型； 树突细胞； T淋巴细胞，细胞毒性
A study on the anti-HBV effect of dendritic cell from human umbilical cord blood CAI Da-chuan, LI Jing, ZENG Yan, LI Yong-guo, REN Hong. Department of Infectious Diseases, Second Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China
【Abstract】 Objectives Regarding the strong antigen-presenting abilities of dendritic cells (DC), this study was carried out based on the induction and proliferation of DC derived from human umbilical cord blood; the anti-HBV effect of cytotoxicity T lymphocytes (CTL) activated by those DC pulsed with HBsAg was also carried out to explore a new way to activate the HBsAg-specific CTL. Methods Cord blood was collected from the cord veins of normal placentae after Cesarean sections, from which cord blood mononuclear cells (CBMC) were separated through density gradient centrifugation. The CBMC were cultured in RPMI 1640 with a cytokine cocktail. Pulsed with HBsAg, the DC were prepared to activate the HBsAg-specific CTL among the CBMC. The cytotoxic effect of CBMCs activated by the DC primed with HBsAg was assayed through the killing of those HepG2-S target cells. Results Typical DC could be induced from CMBC cultured with a cytokine cocktail. DC pulsed by HBsAg activated HBsAg-specific CTL, which killed the target HepG2-S cells to some extent. Conclusion DC can be induced from CMBC with the cytokine cocktail and they show a strong antigen-presenting ability. DC produced in this way and pulsed by HBsAg can activate HBsAg-specific CTL in vitro. This might mean that it could be a new way to break the tolerance to HBV in chronic HBV-infected patients.
【Key words】 Hepatitis B virus; Dendritic cell; T-lymphocytes, cytotoxic
DC因其表面有树突状突起而得名，因其独特的形态及强大的免疫激活功能而被认为是一种功能最强的抗原呈递细胞。与巨噬细胞和B细胞相比，DC激活T细胞的能力是它们的100～1000倍，最显著的特征是能够刺激初始型T细胞增殖，而B细胞和巨噬细胞只能刺激记忆型或被活化的T细胞，因此DC在诱导细胞免疫应答过程中起着重要作用。现有的研究表明，DC功能缺陷或数量减少与乙型肝炎慢性化或慢性携带状态有直接相关性，而利用负载HBsAg后激活的DC诱导出HBsAg特异性CTL则有望成为治疗CHB的有效手段。然而，由于DC在外周血中含量极低，限制了相关的基础研究和临床应用。目前，在体外分离扩增DC的细胞来源包括脐血、骨髓、外周血CD34+细胞或单核细胞。由于对脐血的基础研究滞后，多年以来，脐血一直被当作废物处置。直到20世纪70年代，随着相关研究发现脐血中造血细胞数量和质量及其造血调控因子可与骨髓媲美，并试用于再生障碍性贫血和白血病等的治疗后，脐血的基础与应用研究才进入崭新的阶段[1]。本研究目的是从脐血中获取单核细胞，在细胞因子组合作用下，诱导扩增出DC，负载HBsAg后激活HBsAg特异性的CTL，于体外检测其对表达HBsAg的靶细胞的杀伤效应。
材料与方法
一、材料
1．脐血来源：脐血从重庆医科大学附属第二医院产科健康产妇剖宫产过程中娩出的胎盘脐带中抽取。
2．主要试剂：RPMI 1640完全培养基：含RPMI 1640粉剂（美国Gibco公司产品）0.01g/ml，胎牛血清（美国HyClone公司产品）10ml，青霉素10000U，链霉素10000U，L-谷氨酰胺0.03g，Hepes（美国Sigma公司产品）0.25g，碳酸氢钠0.13g。重组人干细胞因子、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人IL-4和重组人TNFα均购自英国Peprotech公司。IL-2由北京医科大学免疫系提供。淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司。鼠抗人HBsAg单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司克隆系ZCH16，同种型IgG2b。
3．细胞株：HepG2由重庆医科大学病毒性肝炎研究所保存，表达HBsAg的HepG2-S由李用国博士构建[2]。
4．试剂盒：HBsAg ELISA检测试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司；细胞毒检测试剂盒（LDH释放法）购自德国罗氏诊断有限公司；免疫组织化学染色试剂盒Histostain-Plus Kits（SP9002）购自北京中山生物技术有限公司。
二、方法
1．脐血的采集：由于自然分娩产程长短不一，难以确定胎儿娩出的具体时间，故我们所用脐血均在剖宫产过程中从娩出的胎盘脐带中抽取。由于脐血中红细胞含量远高于成人血，且其红细胞表面负电荷多，使脐血中红细胞沉降率明显较成人血为低。因此，为减少脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cells，CBMC）分离过程中红细胞的干扰，在分离细胞前，先将脐血与3%的明胶溶液按1∶1的比例充分混合，然后37℃孵育15～30min。此过程可大大减少CBMC中的红细胞量。每次脐血的采集量在50～100ml，以淋巴细胞分离液分离后，可得到108级的CBMC，足以满足后续实验的需要。
2．人外周血树突状细胞体外培养扩增：参见文献[3]。
3．DC激活的HBsAg特异性CTL：在取脐血常规分离CBMC，用于DC培养的同时，取得部分CBMC以106个/ml的浓度置于含重组人IL-2（1μg/ml）的完全1640培养基中，先常规培养7d，3～4d换液1次；7d后以10mg/L的浓度加入HBsAg，继续培养7d，3～4d换液1次；收集细胞并与HBsAg致敏的DC（即5×104个细胞DC与终浓度为10mg/L的HBsAg共孵育1h）以20∶1的比例混合培养，中途换液1次。前述培养过程结束后收集的细胞即为HBsAg特异性的CTL。同时分别以靶细胞为不表达HBsAg的HepG2细胞和效应细胞为未经HBsAg致敏的DC所刺激的CBMC为对照组。上述常规培养均在37℃，体积分数5% CO2和饱和水蒸气环境中进行。
4．靶细胞HepG2-S的鉴定：ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg的表达（参照说明书进行）；免疫组织化学法检测HepG2-S细胞中HBsAg的表达。
5．DC诱导HBsAg特异性CTL的检测（LDH释放法）：于收获HBsAg特异性CTL的前1 d将靶细胞HepG2和HepG2-S以1×105/ml加入96孔平底培养板中，常规培养过夜，使细胞贴壁。次日去掉原含血清的培养液，以PBS洗2遍。以下所用培养液均不含血清。收集以前述方法制备的CTL细胞（包括对照组），以PBS洗3次后，室温，1000r/mim，离心5min。效应细胞和靶细胞比（效靶比）按1∶1，5∶1，10∶1分别加入前述96孔板中，终体积为200μl，每个浓度设3个复孔。LDH释放对照组的设计（每组均设3个复孔）：（1）培养液对照组：单纯无血清1640培养液200μl/孔；（2）LDH低释放组：靶细胞100μl/孔+无血清1640培养液100μl/孔；（3）LDH高释放组：靶细胞100μl/孔+细胞裂解液（2% TritonX-100溶液）100μl/孔；（4）效应细胞对照组：分别为效应细胞1×104/孔，5×104/孔，10×104/孔＋培养液100μl/孔。将已加入细胞的96孔板置37℃，体积分数5% CO2培养箱中培养10h。培养结束后将培养板以250×g速度离心10min。每孔取100μl细胞培养上清液，加入96孔平底细胞培养板中，于每孔中加入100μl反应混合液（按说明书准备），室温避光放置30min。将细胞板置于酶标仪中检测492nm的吸光度（A）值。特异性CTL活性的计算方法：CTL细胞毒相对活性＝［（A效靶细胞混合－A效应细胞对照－A低释放对照）/（A高释放对照－A低释放对照）］×100。
6．统计学处理：数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。
结 果
1．DC体外培养过程中形态学观察：CBMC贴壁3～6h后获得黏附细胞，加入细胞因子24 h后可见到贴壁细胞有所减少，而悬浮细胞增多，并呈细胞积聚现象，以后悬浮细胞逐渐增多并具有树突样突起。培养至7d后，可见到大量具有树突样突起的悬浮细胞，并随着培养时间的延长，细胞变大，突起更加明显（图1）。电镜下则表现为核染色质边集，胞浆内溶酶体缺乏，胞膜表面可见大量树枝样突起（图2）。
2．表达HBsAg的靶细胞的鉴定：HepG2-S培养上清液经ELISA检测，HBsAg的表达为阳性；HepG2-S胞内HBsAg的表达经免疫组织化学法检测确定为阳性。
3．DC诱导的CTL对靶细胞的细胞毒作用：HBsAg致敏的DC激活的CTL对HepG2-S靶细胞具有较强的杀伤效应（表1）。
表1 DC激活的CTL对靶细胞的杀伤效应（x-±s，%）
组别 效靶比
1∶1 5∶1 10∶1
CTL/HepG2 16.36±6.42 - -
CTL/HepG2-S 78.09±9.66a 26.88±15.55 22.13±5.90
CBMC/HepG2-S 57.03±9.31 57.08±17.24 90.23±9.27
注：与CTL/HepG2组和CBMC/HepG2-S组相比，a P<0.01
讨 论
脐血的利用具有来源广泛、费用低廉、对供需双方无痛苦、组织相容性好等特点。我们的经验表明，在妇产科及手术室同仁的配合下，完全可以获得足量的脐血用于后续实验及临床应用。国外文献在利用脐血诱生DC时，多是先从中纯化出CD34+干细胞。我们之所以采用CBMC，是基于以下2个原因：（1）纯化CD34+干细胞费用高昂，单独用于方法学、生物学研究尚可，但要用于临床则有困难；（2）虽然CD34+干细胞是DC的主要前体细胞，但并非惟一的前体细胞，如脐血中的单核细胞也能在细胞因子的诱导下生成DC，尽量增加前体细胞有助于获得更多的DC。
T细胞介导的细胞免疫应答在抗肿瘤免疫和抗病毒免疫中起主导作用。T细胞的致敏激活和扩增依赖于抗原呈递细胞呈递相应的抗原多肽和提供共刺激信号，活化后则分泌Th1型细胞因子，诱导机体生成抗原特异性CTL，并通过细胞裂解机制（穿孔素、酶类、蛋白毒素等）、细胞凋亡机制和CTL活化时产生的细胞因子（TNFα、 IFNγ、IL-12等）对肿瘤细胞或病毒所感染细胞产生杀伤或对病毒产生抑制或清除作用[4，5]。DC因其强大的抗原呈递能力而被称之为专业抗原呈递细胞。在HBV转基因小鼠和人体内的研究都发现，HBV的持续感染状态和DC被HBV感染及由其引起的抗原呈递能力的下降有关[6，7]。我们的一系列研究也证实，成人外周血来源的DC于体外负载抗原后能有效地活化HBsAg特异性的CTL,对表达HBsAg的靶细胞具有杀伤效应[2，8]。因此，以DC为基础的免疫细胞疗法就成为可能。另一方面，导致HBV感染不能被彻底消灭的障碍之一就是HBV感染存在母婴垂直传播途径，而这一传播方式使得HBV感染极易慢性化。目前认为，HBV宫内感染对新生儿免疫功能的影响主要是诱导免疫耐受，尤其是T细胞水平的免疫耐受，从而导致宫内感染者的慢性HBV携带状态。从实验结果可以看出，当效应细胞为负载HBsAg的DC活化的CBMC（即CTL），靶细胞分别为不表达和表达HBsAg的HepG2时，两组间杀伤率有明显的差别，且当效靶比为1∶1时出现最大的杀伤效率。不过，意外的是，这两组在效靶比为5∶1和10∶1时，其杀伤率反而降低，导致这种现象出现的原因不清楚，可能与CTL为CBMC来源，其中细胞成分较复杂，负载抗原后细胞之间有相互干扰有关。在C组中，其效应细胞为由未负载HBsAg的DC活化的CBMC，它对表达HBsAg的靶细胞也具有一定的杀伤能力，这可能与细胞因子诱导活化CBMC中的T细胞，使其具有NK细胞样活性，从而也能非特异性杀伤靶细胞有关。
参 考 文 献
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