【摘要】目的 依据干细胞生物学特性，探讨从胚胎到成体肝脏内具干细胞特性细胞的变化状况。方法 分离不同胎龄与日龄小鼠肝脏细胞进行体外培养，观察分离获得的细胞数、培养形成的集落数及生长状态，并对集落进行干细胞表面标记物(c-kit、c-Met、Nestin)、肝细胞表面标记物(AFP、ALB)及胆管上皮细胞表面标记物(CK19）的标记。结果 各组分离的细胞经体外培养均有集落形成，肝干细胞的表面标记提示形成的集落具有肝干细胞特性。其中以第15天胚胎肝脏分离所获的细胞数和培养形成的集落数最多、生长状态最好。15 d后观察的各项指标渐减，细胞生长状态渐差。结论 早期胚胎肝脏中大部分是具有干细胞特性的细胞，随胎龄增加，有干细胞特性的细胞逐渐减少，直至出生第5天仅有少数保持未分化状态的细胞存留在肝脏内。 【关键词】胚胎； 肝干细胞； 干细胞因子受体； 肝细胞生长因子配体； 巢蛋白 Evolution of hepatic stem cells fetal to adult of MouseBIN Wenting， SUN Yan， AN Wei， et al.Reproductive Medical Center，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100069， China 【Abstract】Objective To study the evolution of hepatic stem cells from fetal to adult of mouse. Methods Mice were divided into 5 groups according to the gestational (embryo duration, ED13, ED15 and ED19) or born age (day1 and 5).Hepatic stem cells were isolated and cultured in vitro.The amount of the stem cells as well as their growing situation were observed and compared among groups,and markers of stem cells (c-kit,c-Met,Nestin),hepatic cells (AFP,ALB) and biliary epithelial cells (CK19) were used to identify the cultures.Results All isolated cells of each group grew as colonies in vitro.Their expression of specific markers suggested that they were hepatic stem cells.Among groups,the maximum quantity of isolated stem cells and the best situation of growing (maximum growing colonies) were obtained from ED15 group.The growing status of cells and other markers decreased gradually after ED15.Conclusion It is suggested that a majority of cells have characteristics of hepatic stem cells in early age of fetal liver,and cells which have characteristics of hepatic stem cells decrease gradually,only a few cells keep undifferentiating state along with the gestational age until born age (day5). 【Key words】embryon; hepatic stem cell; stem cell factor receptor; hepatocyte growth factor receptor; nestin 肝脏损伤后有强大的再生修复能力。目前认为参与肝修复的细胞有三种来源：一是通过肝细胞自身的有丝分裂，这在正常肝细胞代谢及轻度肝损伤中起主要作用；二是通过肝脏干细胞激活、向肝细胞分化进行修复，这发生于较重的肝损伤时；三是骨髓造血干细胞具有向肝细胞分化的能力。这三种细胞可作为肝细胞修复的潜在来源。1956年Farber［1］发现直径约10 μm的肝卵圆细胞，之后证明其具有分化形成肝细胞和胆管细胞的双向潜能，被认为是肝脏的干细胞［2］。Yin等［3］对肝干细胞进行培养，在添加多肽及甾体类生长因子后，向肝细胞分化，一定条件下出现胆管样结构及胆管上皮标志物的表达。Suziki等［4］发现，将肝干细胞种植在胰腺内能分化为胰腺腺泡及导管，种植于十二指肠则可发育成肠道上皮细胞。由于肝干细胞有多向分化潜能，在肝脏损伤修复方面具有重大的临床应用价值，因此对其获取和体外增殖培养成为倍受医学界关注的研究内容之一。 对于成体肝干细胞来源的认识尚未统一，一般认为肝干细胞是多源性的，可分为非肝源性和肝源性两大类。前者现有三种观点：（1） 来源于骨髓／造血干细胞［5］；（2） 来源于胰腺上皮细胞［6］；（3） 来自胚胎干细胞［7］。后者包括：（1） 成体门管区内有一群未分化肝干／祖细胞，正常时处于休眠状态，肝脏严重损伤时可被活化，增殖为肝卵圆细胞［8］，其增殖数量与肝损伤程度呈正相关，继而分化成肝细胞［9］；（2） 来自胚胎肝细胞的残留［10］。本研究取材于小鼠胚胎和出生后肝脏，观察不同胎龄和日龄小鼠肝脏中有肝干细胞生物学特征细胞的变化情况，以探讨从胚胎肝到成体肝中具干细胞特性细胞的变化规律。 材料与方法 一、实验动物分组 ICR成年小白鼠雌鼠50只，雄鼠6只，由首都医科大学SPF级动物部提供。将雌雄以2∶1的比例合笼过夜。次日晨查，有阴栓者定为妊娠0日，进行胎龄计算，实验动物分成5组，即第13天、第15天、第19天胎鼠和生后第1天、第5天乳鼠，每组10只。 二、主要试剂 兔抗人白蛋白（ALB）抗体、兔抗小鼠细胞角蛋白19（CK19）抗体购自北京Gene公司，兔抗人甲胎蛋白（AFP）多克隆抗体购自北京中山公司。兔抗大鼠、小鼠、人干细胞因子受体（c-kit）抗体，兔抗大鼠、小鼠、人肝细胞生长因子受体（c-met）抗体，兔抗大鼠、小鼠、人巢蛋白（nestin）抗体，SABC免疫组化及显色试剂盒均购自武汉博士德公司，Percoll离心液购自北京科海军洲生物公司，Ⅳ型胶原酶购自北京天来生物公司。胎牛血清购自美国Hyclone公司。 三、肝细胞分离 (一) 酶消化法制备肝细胞悬液解剖镜下取出肝脏，物理天平（精确到0.001 g）测量重量，用含0.1%青链霉素（青霉素与链霉素1∶1）的Hanks液清洗，剪碎，置于离心管中；滴加1∶1混合的0.25%胰蛋白酶液与0.1％Ⅳ型胶原酶液，于37℃震荡消化30 min（乳鼠肝消化约50 min）；再加等量含15% FBS的DF12培养液中和吹打，150目筛网过滤，4℃条件下，2000 r/min离心10 min，弃上清，用DF12培养液悬浮细胞。 (二) Percoll梯度离心法分离肝细胞取Percoll和9％NaCI溶液以9：1比例配成等渗液，再用D-F12培养液将等渗液配成50％、70％、90％的梯度离心液。从离心管底部开始逐层铺加90％、70％、50％Percoll液，每梯度5 ml，最后将细胞悬液置于最上层，4℃12 000 r/min，离心30 min。小心吸取位于50％与70％Percoll层间的细胞，用含0.1%双抗的Hanks液清洗细胞2次，离心10 min（2000 r/min）。弃上清，加培养液至1 ml，将细胞团重悬于其中，台盼蓝染色细胞计数，计算每毫升细胞密度即为分离所得细胞总数，调整细胞密度至2×106/ml接种于25 cm2培养瓶中。 四、肝细胞体外培养 (一) 肝细胞的原代体外培养将培养 瓶置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，培养液为含15%FBS的D-F12培养液，24 h换培养液一次，之后每2～3天换液一次，每天镜下观察培养瓶中细胞生长及增殖变化状态，并记录集落数目。 (二) 肝细胞的传代培养 细胞长满培养瓶底后，用含0.1%双抗的Hanks液清洗培养瓶内细胞2次，0.25%胰蛋白酶液0.8 ml消化，镜下观察细胞回缩即终止（约3～4 min），添加1 ml培养液轻轻吹打培养细胞呈悬浮状，台盼蓝染色计数，调整细胞密度至2×106/ml，接种于新培养瓶中传代培养。 五、肝细胞集落生物学特性的鉴定 采用链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合物技术（SABC）对肝细胞集落进行多种肝干细胞表面标志物的标记，标记方法参照SABC试剂盒说明书进行操作。标记物有ALB、AFP、c-kit、c-Met、Nestin、CK19（AFP、c-kit、c-Met、nestin、CK19以1∶100稀释，ALB以1∶2 000稀释）。 六、统计学处理 用SPSS 12.0软件进行数据处理，采用完全随机单因素F检验。 结果 一、肝脏平均重量 对实验各组单个肝脏平均重量的称量结果显示，胚胎肝重从胚胎第13天到第15天，平均每日增长8.2 mg，从胚胎第15天到第19天，平均每日增长10.6 mg，从胚胎第19天到生后第1天，平均每日增长1.6 mg，而生后第1天到第5天，平均每日增长3.6 mg。提示胚胎肝脏的快速生长期在第15天左右。各组单个肝脏的平均重量见表1。表1（略） 二、肝细胞的分离 (一) 梯度离心结果 Percoll梯度离心后，各组细胞大致分为3层，50% Percoll的上层，50％与70％Percoll间的中层和70％与90％Percoll间的下层。实验各组的分层结果显示，一组几乎无上层，仅有中层和下层细胞，二组上层仅为一薄层脂肪样物质，三、四组上层明显增厚，五组上层厚，中层薄。 (二) 分离所获细胞数（50％与70％Percoll层） 以肝脏个数为单位（10个），所获细胞数由多到少依次排列为实验三、二、四、五、一组，且五组和一组间细胞数无统计学差异；以肝脏重量为单位（0.5 g），所获细胞数由多到少依次排列为实验二、三、一、四、五组，且各组细胞数两两比较均有统计学差异。各实验组分离所获细胞数见表1。 三、分离细胞体外培养与鉴定 (一) 原代肝脏细胞体外培养概况 各实验组细胞在接种约5 h后开始贴壁，于接种后第2天（以原代接种当天为第1天）出现集落样生长的克隆球。镜下观察单层贴壁生长的细胞界限清晰，呈圆形或多边形，排列整齐，胞浆较丰富，胞核呈圆形，其中夹杂少量成纤维细胞。呈集落样生长的克隆球，细胞形态均一，呈圆形，亦有椭圆形，胞核圆或椭圆形。 (二) 集落高峰出现时间与数量 体外培养出现集落最多数由多到少依次排列为实验二、一、三、四、五组，各组细胞数两两比较均有统计学差异。观察结果显示，实验一、二组在接种后第2天就出现集落数高峰，一组约3 000余，二组约4 000余（25 cm2培养瓶）（见图1）；实验三组在接种后第3天出现集落数高峰，约1 000～2 000；实验四组在接种后第4～5天出现集落数高峰，约数百到1 000；实验五组仅在接种后第2天出现极少数几个集落，几天后集落脱落、死亡。体外培养原代集落存活时间及细胞生长状态以实验一、二组集落存活时间长且稳定，实验三、四组次之，但三、四组稳定生长的集落均较一、二组大，实验五组不仅集落存活率极低，且细胞生长状态也极差，无法传代。各实验组出现最多集落数见表1。 (三) 集落鉴定和存活时间与状态 实验一、二组集落存活时间长且稳定，约1／3能稳定存活到传代，镜下观察集落透明、贴壁牢固、边界清楚（见图2）；约1／2的集落几天后逐渐增殖呈片状、不规则状相互融合，或逐渐松散分化（见图3）；少数集落变黑、漂浮、死亡。实验三组、四组约半数集落存活时间较短，1周后变黑、漂浮，另半数集落能稳定生长，镜下观察集落较大、圆形或椭圆形、贴壁牢固，细胞长满瓶壁后可进行传代。实验五组的极少数几个集落存活率极低，2～3 d后变黑、脱落、死亡，瓶内散在贴壁生长的细胞培养10 d后也大部分脱落，无法进行传代。采用SABC法对原代接种后第2天培养中的集落细胞进行干细胞表面标记物c-kit、c-Met、Nestin，肝细胞表面标记物AFP、ALB及胆管上皮细胞表面标记物CK19的标记，结果显示集落细胞c-kit、c-Met、nestin和AFP呈阳性表达，ALB和CK19呈阴性表达，而对原代接种后培养1周的集落细胞进行标记，结果显示部分集落细胞ALB和CK19可呈阳性表达。见图4（略）。 图1（略）图2（略） (四) 传代培养可进行传代的各实验组所传代数没有显著性差异。本实验已将实验一～四组的细胞传至第5代，各组传至第3代之前约6～9 d细胞长满培养瓶底后进行传代，传代培养2 d后出现边界清晰、隆起生长的克隆球，且细胞数目渐多、体积增大，渐成集落，但至一定天数（6 d左右）后集落逐渐松散分化。第4代各组细胞几乎未见集落样生长，细胞增殖渐缓，约2周细胞长满瓶底后传代，第5代各组细胞未见集落样生长，细胞增殖不明显，不具备继续传代条件。图3（略） (五) 50% Percoll上层细胞培养接种后原代培养时多数细胞未贴壁，少量贴壁细胞也随着培养时间的延长而逐渐漂浮、死亡，难以传代。 讨论 关于肝干细胞，Alison等［11］认为在胚胎时期原始肝细胞围绕门脉形成双层柱状结构，这些双层细胞在肝脏发育过程中向门脉间充质组织内迁移，并重构形成肝内胆管，并一过性表达肝细胞及胆管上皮细胞的表面标志，因此提出成体肝干细胞可能是胚胎肝细胞的残留。Kruglov等［12］也认为肝脏发育中胚胎原始肝细胞是成体肝细胞和胆管细胞的祖细胞。基于上述理论，胚胎肝脏中含有的原始肝细胞应具有成体肝干细胞基本特性，即具有自我增殖和向肝细胞或胆管细胞分化的双分化潜能，但关于胚胎发育不同阶段胚胎肝细胞的数目、生长状态、增殖分化能力等状况至今未见系统报道。 本实验借鉴梯度离心分离肝卵圆细胞的方法，获得了实验各组的中层细胞，并将其进行体外培养，这些细胞呈干细胞生长特性，即集落样生长，每个集落细胞数量多，边界清晰，体积随培养时间的延长而增大，传代后仍呈集落样生长。由于尚未发现肝干细胞特异性的表面标志，只能利用细胞表面标志的组合进行筛选［11］，因此我们对集落进行了多项指标的标记，结果显示原代接种后早期形成的集落细胞c-kit、c-Met、nestin和AFP呈阳性表达，ALB和CK19呈阴性表达，而培养1周后的标记结果显示，部分集落细胞ALB、CK19呈阳性表达。这些标记物中c-kit、c-Met和nestin是干细胞标记物，AFP、ALB为肝细胞标记物，而CK19则是胆管上皮细胞标记物［13，14］。提示早期形成的集落细胞是具有双向分化潜能的肝干细胞，处于未分化阶段；而培养1周后，部分集落向肝细胞或胆管上皮细胞方向分化，同时也提示ALB及CK19阳性表达的集落细胞源于经梯度离心获得的胚胎肝脏中的中层细胞。 本实验结果显示，具干细胞特性的胚胎原始肝脏细胞在肝脏内的含量随胎龄、日龄变化，从肝脏平均重量分析，胚胎肝脏体积增加显著，其快速生长期在第15～19天阶段，因此我们以重量为单位进行了集落数的再计算，发现从单位重量（0.5 g）中分离出的中层细胞数和体外培养获得的集落形成数从第15天开始呈递减趋势，提示在胚胎第15天左右，胚胎原始肝细胞形态、密度均一，绝大多数是具有双向分化能力的肝干细胞。从差额结果中可见，第13天和第19天的肝干细胞总数均不及第15天（本实验分组以第13天胎鼠开始，是由于小鼠胎肝在第13天左右才能在解剖镜下辨清剥离，小鼠孕期为20天），体外培养集落数少于第15天组，提示具有干细胞特性的细胞并非只是胚胎原始肝细胞；此外差额结果还证实，出生后肝脏中具有干细胞特性的细胞数显著减少。 从集落传代生长结果分析，自胚胎时期和出生第1天肝脏中获取的集落样生长的克隆球可传至3代，因本实验体外培养使用的是15%FBS的D-F12的普通培养液，未使用饲养层和添加其他任何生长因子，因此与添加生长因子、多种氨基酸培养至98代的结果不同［15］，而生后第5天肝脏中集落样生长的克隆球培养几天后便脱落、死亡，细胞生长状态很差。提示出生后肝脏中具有干细胞特性细胞不仅数量减少，而且自我增殖能力减弱，但本实验并不能排除这些细胞自我增殖能力可在特定环境下恢复。 综上所述，胎龄15 d左右小鼠肝脏中大部分肝细胞为具有干细胞特性的细胞，之后逐渐减少，但至出生5 d仍有少数保持未分化状态的细胞存留在肝脏内。本实验结果提示在胚胎发育过程中，少数原始肝细胞保持未分化状态存留在肝脏内持续至成年期，提示成体肝干细胞可能是源于胚胎肝干细胞的残留，但不能排除成年后会有骨髓／造血干细胞的迁入。 (本研究由肝脏保护再生调节北京市重点实验室资助) 参考文献 1Farber E.Similarities in the sequence of early histological changes induced in the liver of the rat by ethionine, 2-a cetylamino-fluorene, and 3’-nethy1-4-dimethylaminoazobenzene. Cancer Res, 1956,16:142-148. 2Strom S, Fisher R. Hepatocyte transplantation∶ new possibilities for therapy. Gastroenterology,2003,124∶568-571. 3Yin L, Sun M, Ilic Z, et al. Derivation,characterization,and phenotypic variation of hepatic progenitor cell lines isolated from adult rats. Hepatology,2002,35∶315-324. 4Suzuki A, Zheng YW, Kaneko S, et al. Clonal identification and characterization of self renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol,2002,156∶173-184. 5Lagasse E, Connors H, AlDhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med, 2000,6∶1229-1234. 6Dabeva MD, Hwang SG, Vasa SR, et al. Differentiation of pancreatic epithelial progenitor cells into hepatocytes following transplantation into rat liver. Proc Natl Acad Sci USA，1997,94∶7356-7361. 7Yamada T,Yoshikawa M, Kanda S, et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytelike cells identified by cellular uptake of indocyanine green. Stem Cells,2002,20∶146-154. 8Petersen BE, Grossbard B, Hatch H, et al. Mouse A6positive hepatic oval cells also express several hematopoietic stem cell markers. Hepatology,2003,37∶632-640. 9Lowes KN, Brennan BA, Yeoh GC, et al. Oval cell numbers in human chronic liver diseases are directly related to disease severity. Am J Clin Pathol,1999,154∶537-541. 10龚雪,刘慧雯. 肝干细胞的来源与移植应用. 中国临床康复 ,2005,9∶186-188. 11Alison M, Sarraf C. Hepatic stem cells. J Hepatol,1998,29∶676682. 12Kruglov EA, Jain D, Dranoff JA. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J Investig Med,2002,50∶179-184. 13Tanimizu N, Tsujimura T, Takahide K, et al. Expression of Dlk/Pref1 defines a subpopulation in the oval cell compartment of rat liver. Gene Expr Patterns,2004,5∶209-218. 14Sun XY, An J. Expression of nestin,an intermediate filament protein,in human fetal hepatic stem cells. Di Yi Jun YiiDa Xue Xuebao,2004,24∶207-209. 15薛玲,文剑明 ,吴惠茜 ,等. 大鼠肝卵圆细胞的诱导增生、分离、体外培养和性质鉴定. 中华病理学杂志 ,1998,27∶149-150. 《肝脏》杂志社 版权 |