【摘要】目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DC)经HBsAg、HBcAg活化后的免疫功能。方法从慢性乙型肝炎患者外周血中培养扩增DC，在DC成熟前，加入纯的HBsAg、HBcAg刺激，用流式细胞仪检测DC表型，用液闪计数仪观察DC对T细胞的增殖作用，用ELISA法检测混合淋巴细胞反应（MLR）中细胞因子的分泌水平。结果 经HBcAg刺激DC的CD86表达率为（92.14±5.12）%,明显高于HBsAg刺激组和未加抗原组(P<0.01)；经HBcAg刺激组DC诱导同种异体静止T细胞增殖的能力每分钟液闪计数值(cpm)为34 259±3 127，明显高于HBsAg刺激组(20 258±2 917)和单个核细胞组(3 469±417),P<0.01；经HBcAg刺激组DC MLR中IL12浓度为（342±42.3）ng/L,分别高于HBsAg刺激组和未加抗原组(P<0.01)。结论 体外经HBcAg刺激DC可有效提呈抗原病毒，并可进一步刺激T细胞产生。 【关键词】乙型肝炎，慢性； 树突状细胞； T淋巴细胞，细胞毒性 Some immune functions of dendritic cell activated by HBsAg and HBcAg in patients with chronic hepatitis B.An in vitro studyKANG Peng, LV Shulan, LI Shuchen, et al.Department of Infectious Diseases,The Second Affiliated Hospital，Harbin Medical University，Harbin 150086, China 【Abstract】Objective To study immune function of dendritic cell(DC) in patients with chronic hepatitis B after stimulated with HBsAg and HBcAg in vitro. Methods DC proliferated from patient's peripheral blood monocytes was stimulated with pure HBsAg、HBcAg before maturation .The expression levels of DC surface molecule were analyzed by flow cytometry and the ability of DC to induce T lymphocyte proliferation were evaluated by a liquid scintillation counter and the amounts of cytokines in MLR were measured. Results The expression rate of CD86 ［(92.14±5.12)%］ of DC after stimulated with HBcAg was increased compared with that stimulated with HBsAg and controls (P<0.01). And the ability of DC after stimulated with HBcAg to induce T lymphocyte proliferation(cpm value was 34 259±3 127) was significantly higher than that of stimulated with HBsAg(20 258±2 917)and controls(3 469±417),P<0.01.The concentration of IL12 in MLR of stimulated with HBcAg was (342±42.3)ng/L was more than that of DC after loading with HBsAg and controls (P<0.01).Conclusion Human dendritic cell stimulated with HBcAg in vitro can efficiently present antigen and stimulate the production of specific CTL to HBV. 【Key words】Hepatitis B,chronic； Dendritic cells；T lymphocytes； cytotoxic 树突状细胞（DC）是目前机体内功能最强的抗原提呈细胞，在增强或调节细胞介导的免疫反应中起决定性作用［1］。研究表明，慢性乙型肝炎患者存在DC表型及功能缺失，可能是由于其共刺激分子表达降低或细胞因子产生减少所致，提示DC在乙型肝炎的发病中起一定作用［2］。以往研究多集中在以HBsAg为免疫原对DC进行活化,而缺少对HBcAg这一在乙型肝炎免疫病理中扮演重要角色的抗原肽的研究。本研究应用无血清培养基在慢性乙型肝炎患者外周血中分离培养出DC，以HBsAg、HBcAg刺激，然后对其细胞表型、免疫激发能力及分泌细胞因子能力进行检测，为以后基于树突状细胞的慢性乙型肝炎免疫治疗奠定基础。 材料与方法 一、研究对象 慢性乙型肝炎患者28例，其诊断符合2000年西安全国传染病与寄生虫病学术会议修订的诊断标准［3］。男18例，女10例，平均年龄30.6（20～45)岁，丙氨酸氨基转移酶平均值168 U/L(89～312 U/L) ，血清胆红素在正常范围内，不合并肝硬化、肝癌及其他类型肝炎，同时排除药物和饮酒等其它原因造成的肝损伤。 二、主要试剂 AIM-V无血清培养基购于Gibco公司，重组人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）购于军事医学科学院基础研究所，重组人白细胞介素-4（rhIL-4）购于Promega公司，丝裂霉素Ｃ购于Promega公司，人淋巴细胞分离液（1.077 g/L）购于中国医学科学院血液研究所，人IL-12酶联免疫试剂盒购于深圳晶美生物制品公司，FITC标记的鼠抗人CD80、CD86单克隆抗体购于Becton Dickinson公司，［3H］标记的胸腺嘧啶核苷购于中国原子核能研究所，重组HBsAg、HBcAg由黑龙江省疾病控制中心惠赠。 三、树突状细胞的分离培养 无菌采集人外周静脉血20 ml，肝素钠（427 U/ml）抗凝，人淋巴细胞分离液与外周血以1∶1比例加入离心管以密度梯度离心（2 000 r/m）20 min，然后用吸管轻轻吸出位于血浆层与淋巴细胞分离液层之间的单个核细胞（PBMC）层。用PBS洗2次，然后用AIM-V无血清培养基悬于25 ml培养瓶中，放入37℃ 5%CO2培养箱孵育1 h。用PBS洗去未贴壁细胞，弃液，然后加入含GM-CSF（500 U/ml）、IL-4（1 000 U/ml）的AIM-V无血清培养基，重新放入37℃ 5%CO2培养箱中培养7 d，每2天换一次液，第7天收获悬浮的细胞即为DC。 四、细胞形态分析 用PBS洗上述DC两次，以1 000 r/m离心5 min，去上清，加入2.5%戊二醛固定，过夜，然后用梯度酒精脱水，石蜡包埋，并行超薄切片，铅铀染色后透射电镜观察并摄片。 五、树突状细胞表面表型的检测 收获第7天的DC,用PBS洗2次,取5×105个DC用AIM-V无血清培养基悬浮后分装到4个EP管中, 分别以0、10 μg/ml的浓度加入HBsAg、HBcAg，放在37℃ 5%CO2培养箱中作用1.5 h,之后悬于FACS标记液（PBS+2%胎牛血清白蛋白+0.1％叠氮钠）100 μl中，加入FITC标记的鼠抗人CD80、CD86单克隆抗体各20 μl，4℃避光30 min，然后用PBS洗细胞2次上流式细胞仪，检测DC的膜表面标志，计算5×104个细胞中特异标记阳性细胞的百分比。 六、混合淋巴细胞反应（MLR） (一) T细胞准备 为排除不同个体间的差异，T细胞取自同一个健康正常人。采用密度梯度离心方式获取PBMC，然后贴壁去除单核细胞，其余留作T细胞之用。 (二） DC对HBsAg、HBcAg的提呈作用检测 收集培养7 d的DC，用AIM-V无血清培养基悬浮后分装到4个EP管中（6.4×104/管），分别以0、10 μg/ml的浓度加入HBsAg、HBcAg，放在37℃ 5%CO2培养箱中作用1.5 h。然后用丝裂霉素C(40 mg/L)处理0.5 h，与10倍DC细胞数的自体T细胞混悬，加入96孔板，每组设3个复孔。放在37℃ 5%CO2培养箱中培养5 d，于培养48 h取上清，-70℃冻存留做检测细胞因子。结束培养前13 h加入37 kBq/孔（1μCi=37 kBq）3H胸腺嘧啶核苷。以多头细胞样品收集仪收集DC，80℃干燥30 min，收获细胞，用γ液体闪烁计数仪测定cpm。 七、细胞因子检测 取出-70℃冻存的上清，采用ELISA法，检测每个样品的IL-12 OD450值，然后根据标准曲线算出相对应的浓度值。 八、统计学分析 采用配对t检验。 结果 一、DC形态和超微结构 GM-CSF是DC发育成熟所必需的细胞因子，IL-4可以抑制单核细胞向巨噬细胞转化并维持DC成熟，使用含上述两种因子的AIM-V无血清培养基培养DC，于培养的1～2 d可见细胞贴壁呈单层均匀分布，3～4 d可见细胞呈簇状生长，形成大小不等的DC集落，至培养7 d，可见大部分细胞脱落，形态不规则，在倒置相差显微镜下可见细胞表面有许多毛刺，为典型DC（见图1）；用透射电镜观察成熟DC，可见DC表面有毛刺样突起，胞核偏位，胞浆富含线粒体而较少溶酶体（见图2）。 图1(略) 图2（略） 二、DC表型分析 流式细胞仪检测结果见表1。可见慢性乙型肝炎患者外周血DC的CD86表达率在HBcAg刺激组和HBsAg刺激组均明显高于对照组(P<0.01)。而HBcAg刺激组CD86表达率与HBsAg刺激组相比有显著差异(P<0.05)。三组间CD80表达无显著差异。 表1（略） 三、DC刺激同种异体T细胞增殖的能力 在MLR中, HBcAg刺激组DC的每分钟液闪计数(cpm)值为34 259±3 127，明显高于HBsAg刺激组(20 258±2 917，P<0.01)。而两者的cpm值均高于PBMC阴性对照组(3 469±417，P<0.01),可见DC的免疫刺激能力远高于PBMC。 四、MLR中IL-12分泌水平 在MLR中,HBcAg刺激组IL-12含量高于HBsAg刺激组(P<0.05),也显著高于阴性对照组(P<0.01)，结果如表2所示。 表2（略） 讨论 慢性乙型肝炎患者存在DC数量和功能缺陷，无法诱导初次免疫应答和激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应，同时也可能导致记忆性T、B细胞缺失，使机体无法对病毒抗原再次产生免疫应答［4］。因此，在机体外扩增DC的同时采用病毒抗原冲击致敏DC，再回输体内，可以诱导抗原特异性免疫反应。 机体清除乙型肝炎病毒(HBV)的重要方式是通过依赖于HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子限制的CD8+的CTL介导的细胞免疫应答，而在HBV慢性感染者体内CTL应答往往是低下的。T淋巴细胞活化为杀伤活性的CTL除接受HLA分子第一信号外，APC表面的CD80(B7-1)、CD86(B7-2)等提供第二信号给T细胞表面的CD28受体，形成强烈的共刺激信号，活化CTL等免疫活性细胞，从而清除病毒［5］。本实验中DC经抗原刺激后可能增强了HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子及其表面各种共刺激分子的表达，使其能够有效地向T细胞提呈抗原信息，从而产生强烈的CTL反应。 IL-12是迄今为止所发现的DC细胞释放的最有效CTL和NK细胞活性刺激因子，在机体抗病毒过程中发挥关键作用［6］。大量的IL-12可活化T细胞产生内源性IFN-γ,通过CTL反应使靶细胞发生程序性死亡。 我们在以往的研究中已证实，慢性乙型肝炎患者外周血DC免疫功能低下，并与DC表面CD86表达率下降及IL-12分泌减少密切相关。本实验分别以HBsAg、HBcAg刺激DC后，其共刺激分子CD86表达明显增高，且以HBcAg刺激组更为显著。HBcAg刺激组DC分泌IL-12，刺激T细胞增殖的能力也较其他组显著。目前认为HBcAg是免疫细胞攻击的主要靶抗原，使感染肝细胞成为靶细胞被破坏。HBcAg表现出的高免疫原性与其既能直接激活B细胞，又能作为一种强有效的T细胞免疫原活化T细胞有关，HBcAg的颗粒型结构和内部的Th位点是与HBsAg比较具有的另一优势。提示以HBcAg负载的DC可以有效诱导HBcAg特异性CTL细胞效应。因此用HBcAg刺激来恢复慢性乙型肝炎患者DC的抗原提呈功能，将有助于患者免疫系统清除病毒。这为今后利用DC制备疫苗治疗慢性乙型肝炎开辟了新道路。 参考文献 1Nicol A,Nieda M,Koezuka Y,et al. Dendritic cells are targets for human invariant Valpha 24+ natural killer Tall cytotoxic activity:an important immune vegulatory fanctior .Exp Hematd,2000,28∶276. 2邢利和，王福生，刘明旭，等.慢性乙型肝炎患者树突状细胞的培养鉴定和功能特点.中华传染病杂志，2001，19∶348. 3中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.肝脏，2005，5∶257-263. 4Wang FS, Xing LH, Liu MX, et al. Dysfunction of peripheral blood dendritic cells from patients with chronic hepatitis B virus infection .World J Gastroenterol ,2001,7∶537-541. 5Akbar SMF,Horilke N，Onji M.Prognostic importance of antigen presenting dendritic cells during vaccine therapy in a murine hepatitis B virus carrier.Immunology,1999,96∶98-108. 6Huang LY,Reis SC,Itoh Y,et al.IL-12 induction by TH1 inducing adjuvant in vivo : dendritic cell subsets and regulation by IL-10.J Immunol,2001,167∶1423-1430. 《肝脏》杂志社版权 |