【摘要】目的研究乙型肝炎病毒(HBV)及其C区突变对机体人类白细胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ)表达的影响和机制。方法构建HBV C区突变株G87、V60的真核表达载体，转染HepG2细胞，检测转染细胞中HLA-Ⅰ的表达以及抗原提呈相关基因LMP2、TAP1和tapasin的mRNA表达。结果各转染细胞株均能有效表达HBsAg；各转染细胞株均有HLA-Ⅰ表达，野生株略高于C区突变株G87、V60；TAP1 mRNA表达上调，LMP和tapasin mRNA均未见明显 表达。结论HBV能诱导HepG2细胞内HLA-Ⅰ分子的合成，使TAP1基因转录增强，HLA-Ⅰ的表达上调。相对于HBV野生株而言，C区突变株G87、V60使宿主细胞内HLA-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平降低。 【关键词】肝炎病毒，乙型； 突变； HLA-Ⅰ分子； 调节 Study of the influence of HBV wild type and nucleocapsid mutants on HLA-Ⅰ expression WANG Jiuping, WANG Linxu, LI Jun, et al.Department of Infectious Diseases, Tangdu hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, China 【Abstract】ObjectiveTo study the influence of hepatitis B virus (HBV) wild type and nucleocapsid mutants on HLA-Ⅰexpression. MethodsEukaryotic expression vectors of HBV core region mutation G87 and V60 were constructed and transfected into HepG2 cells. HBsAg in the supernatant of transfected cells culture was detected by ELISA. The mRNA of HLA-A gene and antigenpresentationassociated genes, including LMP2, TAP1 and tapasin, were measured by RTPCR. The expression of HLA-Ⅰwere tested by western blot. ResultsEach transfected cells can express HLA-Ⅰmolecules especially in the wild group. It was also found that the mRNA of TAP1 gene was upregulated while the mRNA of LMP and tapasin genes had no change. ConclusionHBV can induce the expression of HLA-Ⅰand TAP1 in HepG2 cells. 【Key words】Hepatitis B virus; Genes; Mutation; HLA-Ⅰmolecules; regulation 宿主感染乙型肝炎病毒（HBV）后表现出不同的临床发展过程，包括一过性抗原血症、自限性急性肝炎、慢性病毒携带、亚临床肝损害、进行性肝损害乃至肝硬变，除与病毒本身有关外，更重要的是由于个体对HBV产生的免疫反应不同。人类的主要组织相容性复合体（MHC）是编码人类白细胞抗原（HLA）的基因群，称为HLA复合体，为目前已知最复杂的人类基因复合体，与免疫因素有关，可能影响HBV感染后的不同转归。HBV C区编码基因相对保守，其编码的核心蛋白是宿主免疫反应攻击的主要靶抗原，但该蛋白常可自然发生或在治疗后发生不同类型变异，我国主要流行的HBV adr亚型常见87位丝氨酸AGC被甘氨酸GGC替代（G87变异），60位亮氨酸CTG被缬氨酸GTG替代（V60变异）［1］。为研究HBV核心蛋白突变后HLA-Ⅰ表达的强度，我们通过构建HBV核蛋白变异株G87、V60的EB病毒表达载体并转染HepG2细胞，观察其对HLA-Ⅰ表达的影响，探讨HBV对HLA-Ⅰ表达的调节机制。 材料与方法 一、材料 含1.2拷贝的HBV adr型基因组野生株及C区变异株G87和V60的表达载体EBOWT、EBOG87和EBO-V60均由本室构建；HepG2细胞为本室保存；RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒购自Promega公司；Lipofectamine为Gibco公司产品；DMEM购自R&D公司，胎牛血清为四季青公司产品；HBV表面抗原(HBsAg) ELISA定量测定试剂盒为Abbott公司产品，鼠抗HLA-ABC mAb W6/32由本校免疫学教研室提供，HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中山公司。 二、方法 (一) 重组载体转染HepG2细胞 取空载体EBO及EBO-WT、EBO-L97、EBO-G87和EBO-V60各4 μg，经10 μl脂质体Lipofectamine介导转染HepG2细胞，潮霉素200 mg/L筛选，每2天半量更换培养液，建立各株的稳定表达细胞。ELISA法检测4株细胞培养上清中HBsAg含量，分别测3次，取均值，以S/N值表示。 (二) 测定HLA-A基因及抗原提呈相关基因mRNA RT-PCR半定量法分别测定各株转染细胞中HLA-A mRNA及抗原提呈相关基因LMP2、TAP1和tapasin mRNA表达水平。根据GenBank中HLA-A DNA序列设计引物，其PCR产物经测序证实为目的基因片段。扩增LMP2、TAP1和tapasin基因的引物序列按Matsui等［2］设计进行，各引物的核苷酸序列及扩增产物长度见表1。 表1（略） 从5×106个转染细胞中提取总RNA，操作按试剂盒说明进行。反转录法扩增HLAA及抗原提呈相关基因LMP2、TAP1和tapasin基因片段，扩增参数为：94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，35个循环，以βactin为内参照，对各扩增产物行琼脂糖凝胶电泳。 三、检测HLA-Ⅰ蛋白的表达分别取5×106个转染细胞，Trizol裂解，取上清30 μl行Western blot检测，一抗为鼠抗人HLA-ABC mAb，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，测定HLA-Ⅰ蛋白的表达。 结果 一、重组载体转染HepG2细胞培养上清HBsAg定量检测 结果显示，各组HBsAg S/N值接近（见表2），表明各株转染率相当，转染效果肯定。 二、转染HepG2细胞中HLAA mRNA表达 结果显示，空载体组未见表达，野生株及C区变异株均出现约500 bp的扩增带，与预期大小相符。EBO-WT、EBO-G87和EBO-V60转染细胞表达产物的条带强度依次呈减弱趋势，β-actin条带强度基本一致（见图1）。表明HBV可上调转染细胞中HLA-A基因的转录水平，但各株HBV之间HLA-A mRNA表达水平有差异。 表2（略） 图1（略） 三、转染细胞中HLA-Ⅰ蛋白的表达 Western blot检测结果显示， 4株重组载体转染细胞的裂解物均出现相对分子质量为45 000左右的条带，与HLA-Ⅰ重链大小一致。4株HBV转染细胞中，HLA-Ⅰ蛋白表达强度由强至弱依次为WT、G87、V60，空载体转染细胞未见蛋白带。表明HBV转染细胞中HLA-Ⅰ表达水平明显上调，4株HBV表达水平有差别，结果与mRNA表达一致。 四、转染细胞中抗原提呈相关基因mRNA的表达 RT-PCR检测HBV重组载体及空载体对照转染细胞中LMP2、TAP1和tapasin基因转录水平，野生株及C区变异株转染细胞均可见381 bp的TAP1 mRNA扩增带，强度无明显差别，空载体转染组可见微弱的条带（见图3）。而各组LMP2 mRNA及tapasin mRNA均未见明显扩增。提示HBV转染的Hep G2细胞中LMP2基因及tapasin基因的转录水平无改变或仅有轻微变化，TAP1基因的转录水平则明显提高，且野生株和C区变异株的表达水平相似。 讨论 乙型肝炎是目前世界上广泛流行的传染病，据估计全球至少有20亿人曾感染过HBV（图3略），约3亿人成为慢转染细胞中TAP1 mRNA的表达性感染者［3］。HLA复合体作为调节机体免疫应答的重要基因群，与抗HBV免疫反应有密切关系，其在HBV感染、清除过程中的作用日益受到重视。HLA-Ⅰ类、Ⅱ类限制性T细胞反应分别在HBV清除过程中发挥重要作用。免疫反应较弱是造成HBV感染慢性化的原因之一，而某些特殊HLA基因型可能影响着HBV感染的慢性化和免疫反应的强弱。尽管乙型肝炎疫苗的免疫预防已经取得了非常好的效果，但是HBV感染者的治疗效果仍不佳，且HBV变异率高于其他DNA病毒4～10个数量级［1,4］。本实验中我们选取了我国流行的adr亚型及其常见变异（G87变异和V60变异）进行相关研究，探讨HBV及其变异株对机体HLA-Ⅰ类分子表达的调节作用。 HLA为目前已知最复杂的人类基因复合体，各基因座位均有众多的等位基因，位于人第6号染色体短臂上，全长3 600 kb，占人类基因组的1/3 000，包括224个基因座位，其中128个为功能性基因，96个为假基因。HLA分子至少具有4个方面的功能：与自身抗原结合,在胸腺进行T细胞选择；与异己抗原结合，递呈给成熟T细胞，引起免疫反应；决定抗原免疫反应表型，即反映不同个体免疫应答的差别；刺激自身或同种异体混合淋巴细胞反应。HLA是首次发现的与疾病有明确关系的遗传系统，与许多疾病有密切关系［5］。 HBV侵入肝细胞后，抗原在肝脏细胞内的表达会引起免疫系统对受感染肝细胞的保护性攻击，并进一步引起肝脏急性或慢性炎症反应。免疫系统通过HLAⅠ类、Ⅱ类免疫途径，制约和调节对HBV抗原的识别和免疫应答过程，对HBV感染和慢性化产生影响。在HBV免疫应答过程中，病毒作为细胞内抗原，主要经过内源性抗原加工和递呈途径启动免疫应答，这些内源性抗原在具有广泛特异性的多蛋白酶体（proteasome）作用下降解成肽段，并通过抗原肽运载体（TAP）运输至内质网与MHC类分子结合［6］，再经高尔基体输送至抗原提呈细胞表面，这些抗原肽与MHC分子结合形成特殊的空间构象，并作为特异信号被特异的CD8+T淋巴细胞受体所识别，从而产生特异的CTL免疫应答。有研究表明，急性HBV感染者大多表现出较强烈的HLA-Ⅰ类限制性CTL反应［7］，而在慢性患者此类反应则大多较弱甚至检不出，而当慢性乙型肝炎急性发作时则CTL反应又趋强烈。可以认为较弱的CTL反应对HBV清除不彻底可能是导致HBV感染慢性化的原因［8］。 我们通过研究发现，HBV野生株及C区变异株转染细胞中HLA-A mRNA、HLA-Ⅰ蛋白及TAP1 mRNA水平均明显高于对照细胞，提示HBV编码蛋白可在转录水平上调HLA-A基因及TAP1基因，从而上调HLA-Ⅰ的表达。HLA-Ⅰ表达的强度主要取决于新合成的HLA-Ⅰ分子与抗原肽段结合的量。TAP1基因表达水平与肽段转运能力通常呈正相关，HBV可诱导宿主细胞HLA-Ⅰ分子的合成量及TAP1 mRNA表达量增加，从而介导HLA-Ⅰ表面表达的增强。HBV转染细胞的内源性细胞因子是否介入调节机制还有待进一步研究。 疾病相关基因的研究己成为当今热点之一，但对病毒性肝炎相关基因的研究才刚刚起步。如果能充分认识HBV DNA基因序列的改变及其与肝脏免疫损伤的关系，确定与HBV感染有关的HLA基因型，将有助于了解遗传因素在乙型肝炎发病中的影响，对乙型肝炎的预测、预防、辅助诊断和预后判断均有重要意义。 参考文献 1骆抗先. 乙型肝炎——基础与临床. 北京:人民卫生出版社, 2001. 64-67,144-154. 2Matsui M, Ikeda M, Akatsuka T. High expression of HLAA2 on an oral squamous cell carinoma with downregulated transportor for antigen presentation. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 280∶1008-1014. 3Zarski JP. Epidemiology of chronic hepatitis B. Presse Med, 2006, 35∶304-307. 4Hunt CM, McGill JM, Allen MI, et al. Clinical relevance of hepatitis B viral mutations. Hepatology, 2000, 31∶1037-1044. 5Lin J, Deng CS, Sun J, et al. HLA-DR B1 allele polymorphisms in genetic susceptibility to esophageal carcinoma. World J Gastroenterol, 2003, 9∶412-416. 6Eric P, Peter C. Mechanisms of MHC class Irestricted antigen processing. Annu Rev Immunol, 1998,16∶323-358. 7Thio CL, Thomas DL, Carrington M. Chronic viral hepatitis and the human genome. Hepatology, 2000, 31∶819-827. 8Momburg F, Mullbacher A, Lobigs M. Modulation of transporter associated with antigen processing (TAP)mediated peptide import into the endoplasmic reticulum by flavivirus infection. J Virol, 2001, 75∶5663-5671. 《肝脏》杂志社版权 |