【关键词】 肝炎病毒，乙型； 细胞凋亡； 基因，X；癌，肝细胞 The effect of HBx gene on the apoptosis of hepatic cells and its possible mechanism YE Lu, QI Jun-ying, LI Gao-peng, TAO De-ding. 【Key words】 Hepatitis B virus; Apoptosis; Gene, X; Carcinoma, hepatocellular 【First author’s address】 Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China Corresponding author: Qi Jun-ying, Email: jyqi@tjh.tjmu.edu.cn 乙型肝炎病毒X基因（HBx）在HBV慢性感染导致肝硬化，原发性肝癌（HCC）的发生过程中，起着重要的作用[1]。X连锁凋亡抑制因子（XIAP）为凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成员，是一种强效的凋亡抑制蛋白，可以抑制半胱氨酸蛋白酶活性，阻断细胞凋亡过程[2]。我们观察了肝癌细胞株以及正常肝细胞株在转染HBx前后凋亡抑制蛋白XIAP表达的差异，了解和分析HBx对不同肝细胞系细胞凋亡的作用及其是否与凋亡抑制蛋白XIAP基因相关。 一、材料与方法 1. 试剂: 逆转录试剂盒、LipofectamineTM 2000及Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素试剂盒为美国Invitrogen公司产品，Taq酶购自日本TaKaRa公司，定量聚合酶链反应（PCR） SYBRGreen PCR Master Mix试剂盒为美国应用生物系统公司产品，XIAP抗体为美国Cell Signaling公司产品 ，免疫细胞化学试剂盒为武汉晶美生物公司产品。 2. 细胞培养：肝细胞系L02以及肝癌细胞系HepG2为本实验室保存细胞株。使用体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液， 3. 质粒构建及脂质体介导的HBx质粒转染HepG2及L02细胞：（1）真核表达载体pcDNA3.1-HBx构建方法参照文献[3]。（2）pcDNA 3.1-HBx质粒或pcDNA3.1空质粒瞬时转染入HepG2细胞和L02细胞：选状态良好的对数生长L02细胞约1×106，用质脂体将pcDNA3.1-HBx或pcDNA3.1 4μl转入L02细胞及HepG2细胞中，并继续孵育72h。将转染细胞分别命名为L02/pcDNA3.1-HBx、L02/pcDNA3.1、HepG2/pcDNA3.1-HBx、HepG2/pcDNA3.1。 4. 转染细胞细胞形态的变化：使用相差显微镜观察各细胞形态。 5. 细胞总RNA的提取及逆转录反应：用Trizol试剂盒分别抽提上述6组细胞总RNA， 6. HBx在转染细胞中的表达：取逆转录产物各2μl为模板，扩增HBx片段，HBx引物：上游：5′-CCCGTCTG TGCCTTCTCATC-3′；下游：5′-GCGTTATGCCTAC AGCCTCC-3′。PCR反应条件为 7. 荧光定量PCR检测凋亡抑制蛋白XIAP mRNA表达：XIAP和GAPDH引物用美国应用生物系统公司引物设计软件Primer Express Version 1.0设计：XIAP上游：5′-TTTTCC AAGTGTAGTCCTGTTTC-3′，下游：5′-GCTGAGTCTCC ATATTGCCATCTA-3′；GAPDH上游：5′-GACCCCTTCA TGACCTCAAC-3′，下游：5′-CTTCTCCATGGTGGTGA AGA-3′。荧光定量PCR按试剂盒说明操作，反应在美国应用生物系统公司7000型荧光定量PCR仪上进行。利用比较CT法检测样本mRNA表达情况。正常L02细胞，HepG2细胞为校正样本，其mRNA表达值均设为1，GAPDH mRNA为内参照，L02/pcDNA3.1和HepG2/pcDNA3.1为阴性对照。重复3次。 8. 免疫细胞化学检测XIAP蛋白表达：取上述6种细胞分别制细胞爬片，待爬片率达70%，按照免疫细胞化学试剂盒说明书操作，检测XIAP蛋白在不同细胞中表达情况。 9. 流式细胞术检测转染细胞的细胞凋亡：分别取上述6组细胞胰酶消化后用磷酸盐缓冲溶液稀释为1×105/ml的细胞悬液，按Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素试剂盒说明操作， 美国BD公司FACSort型流式细胞仪上分析细胞凋亡，重复3次。 10. 统计学方法：所有数据均采用SPSS12.0软件进行分析。组间采用方差分析，进一步两两比较采用LSD法。 二、结果 1. 转染细胞形态：在相差显微镜下可见，转染pcDNA3.1-HBx 72h以后的L02部分细胞由未转染时的圆形变为长梭形，伪足较正常L02细胞增多，细胞膜上泡状突起增多。转染pcDNA3.1-HBx 72h的HepG2细胞膜泡状突起较正常HepG2细胞增多，见图1。 2. HBx在转染细胞中表达：PCR扩增结果显示，转染pcDNA3.1-HBx的L02、HepG2细胞中有HBx的表达，而未转染和转染pcDNA3.1的细胞中未见HBx的表达。 3. XIAP基因mRNA表达：定量PCR结果显示，XIAP mRNA在L02是L02/pcDNA3.1-HBx表达的2.63倍，差异有统计学意义（P<0.01）；在HepG2/pcDNA 3.1-HBx为HepG2表达的3.98倍，差异有统计学意义（P<0.01）。L02/pcDNA3.1、HepG2/pcDNA3.1与未转染细胞表达量无明显差异。 4. XIAP基因蛋白表达：免疫细胞化学结果显示，阳性细胞浆为棕黄色。XIAP蛋白在L02细胞中表达较L02/pcDNA3.1-HBx细胞中稍增强，在HepG2/pcDNA3.1-HBx细胞中表达较HepG2中稍增强，见图2。 5. 细胞凋亡：L02/pcDNA3.1-HBx细胞凋亡率为25.10%±4.34%，与L02（13.33%±1.70%）及L02/pcDNA3.1（13.43%±2.45%）比较明显增加（P<0.01），L02和L02/pcDNA3.1细胞间凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。HepG2/pcDNA3.1-HBx凋亡率为13.60%±2.81%，较HepG2（19.62%±1.97%）及HepG2/pcDNA3.1（21.01%±2.57%）下降（P<0.05），HepG2/pcDNA3.1与HepG2凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。 三、讨论 HBx在肝癌的发生和发展中起着非常重要的作用，是HBV的6个开放阅读框中与肝细胞凋亡联系最紧密的基因序列。研究发现，HBx可以阻止细胞凋亡过程，也有可能通过对各种因素如细胞色素C、肿瘤坏死因子α、Fas抗体进行调控，促进细胞凋亡的发生[4, 5]。本研究中我们在不同的细胞系（L02细胞、HepG2细胞）中导入HBx，发现正常肝细胞系L02细胞经HBx干扰后，凋亡率明显升高，而肝癌细胞系HepG2细胞转染HBx后，凋亡率较未转染细胞略有下降。这提示HBx对不同细胞系影响细胞凋亡的作用不同，对于正常肝细胞系表现为促进凋亡，对于肝癌细胞系则表现为抑制凋亡。与Shih等[6]推测HBx对凋亡影响因不同细胞系及表达系统而异，结果相同。 我们应用荧光定量PCR进一步检测，发现L02细胞中XIAP表达量较L02/pcDNA3.1-HBx细胞中高；而HepG2/pcDNA 3.1-HBx细胞中XIAP表达量较HepG2中高；免疫细胞化学实验结果也与之相符。结果提示在HBx转染L02细胞后，可能通过下调凋亡抑制蛋白XIAP基因的表达来促进正常肝细胞系L02细胞的凋亡；而对于HepG2细胞，HBx则可通过增加XIAP的表达来抑制肝癌细胞系HepG2细胞的凋亡。 我们还观察到，L02细胞在转染HBx后，形态由圆形变为长梭形，伪足增多，类似HepG2细胞，提示L02细胞在受到HBx干扰后可能有癌变倾向。因此推测HBx在正常肝细胞中表达可使正常细胞凋亡增加，并可能促使正常肝细胞癌变；而在肝癌细胞系HepG2细胞中表达，则可能抑制癌细胞凋亡，使癌恶化程度增高。 参 考 文 献 1Kim H, Lee H, Yun Y. X-gene product of hepatitis B virus induces apoptosis in liver cells. J Biol Chem, 1998, 273: 381-385. 2Shiozaki EN, Chai J, Rigotti DJ, et al. Mechanism of XIAP-mediated inhibition of caspase-9. Mol Cell, 2003, 11: 519-527. 3Guo SP, Wang WL. Expression of HBVx gene in hepatocellular carcinoma cell and the effect on apoptosis. Linchuang Yu Shiyan Binglixue Zazhi, 1999, 15: 283-286, 42. 郭双平,王文亮.HBVx基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响.临床与实验病理学杂,1999,15:283-286,42. 4Zhang JL, Zhao WG, Wu KL, et al. Human hepatitis B virus X protein promotes cell proliferation and inhibits cell apoptosis through interacting with a serine protease Hepsin. Arch Virol, 2005, 150: 721-741. 5Kim KH, Seong BL. Pro-apoptotic function of HBV X protein is mediated by interaction with c-FLIP and enhancement of death- inducing signa1. EMBO J, 2003, 22: 2104-2116. 6Shih WL, Kuo ML, Chuang SE, et al. Hepatitis B virus X protein inhibits transforming growth factor-beta-induced apoptosis through the activation of phosphatidylinositol 3-kinase pathway. J Biol Chem, 2000, 275: 25858-25864.
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