【关键词】 肝； 再灌注损伤； 肌肽； 丙二醛 Effect of carnosine on prevention of reperfusion liver injury during hemorrhagic shock and reperfusion in rats FAN Feng-yan, HUANG Ling-zhi, WANG Guang-yi, ZHENG Wei, WANG Bo, ZHOU Hong, WANG Zi-ling. 【Key words】 Liver; Reperfusion injury; Carnosine; Malondialdehyde 【First author’s address】 Institute of Transfusion Research, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China Corresponding author: WANG Zi-ling, Email: wangzl-mm@yahoo.com.cn 组织或器官在一定时间缺血缺氧后会造成损伤，血供恢复后损伤进一步加重称为缺血-再灌注损伤（IRI）。在肝外科IRI是造成术后肝功能衰竭的重要原因之一。肌肽是含组氨酸的二肽类物质的代表，因其具有抗氧化、保护膜完整性、鳌合金属离子、质子缓冲、调节巨噬细胞活性等功能，被认为是具有前景的抗缺血损伤药物[1]。研究认为肌肽对肾脏、心脏、脑的IRI具有保护作用[2]，但肌肽抗肝脏IRI的作用研究较少。我们通过血浆酶学指标、肝组织匀浆丙二醛（MDA）和Na+-K+ATP酶的检测以及肝组织病理改变的观察，探讨肌肽对大鼠重度失血性休克再灌注后肝脏损伤的保护作用及可能的机制。 一、材料与方法 1. 实验动物：雄性Wistar大鼠32只，体重210～ 2. 试剂及仪器：L-肌肽购自成都景田药业，用等渗盐水配制成 3. 实验分组：32只大鼠随机分为假手术组、休克组、再灌注损伤组、肌肽治疗组（90mg/kg），每组8只。假手术组手术后处死；休克组大鼠失血后1h处死；大鼠休克1h后再灌注损伤组经股静脉推注等渗盐水，肌肽治疗组经股静脉推注肌肽溶液，输血后观察3h处死。 4. 动物模型的建立与给药：动物模型的建立参照文献[3]，大鼠用2%戊巴比妥钠（3ml/kg）腹腔注射麻醉，手术分离右颈总动脉并置管用于监测平均动脉压，分离左后肢股动脉、股静脉并置管分别用于放血、给药及血液回输。手术后静脉推注肝素钠（1000U/kg）使大鼠全身血液肝素化，连接多道生理记录仪监测平均动脉压、心电图和肛温。待血压稳定后自股动脉快速放血（1.3ml·min-1·kg-1）至平均动脉压40mmHg，再通过慢速放血将平均动脉压维持20min后放置1h，整个放血过程大鼠共失血45%左右。大鼠休克1h后再灌注损伤组经股静脉推注等渗盐水（2ml/kg），肌肽治疗组经股静脉推注肌肽溶液（2ml/kg），10min内回输全部自体血液，观察3h后处死大鼠。取血液离心分离血浆，取肝右叶两块肝组织，一块制作10%肝组织匀浆，离心取上清液，一块用4%甲醛固定用于组织病理检测。 5. 检测指标及方法：血浆AST、ALT活性、肝组织匀浆MDA、Na+-K+ATP酶、总蛋白定量检测按照试剂盒说明书进行（1nmol/mg的MDA，表示每毫克组织蛋白的组织中MDA的量为1nmol；每小时每毫克组织蛋白中Na+-K+ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位，表示为1μMPi·mg-1·h-1），固定好的肝组织石蜡包埋切片，进行常规HE染色。 6. 统计学处理：实验结果用x-±s表示，所有数据用SAS软件进行成组设计资料的统计分析。 二、结果 1. 肝组织病理检测结果：与假手术组相比休克组肝组织损伤不明显，再灌注损伤组肝组织损伤最重，可见肝细胞轻度水样变，部分肝细胞呈局灶性嗜酸性变，细胞浆嗜伊红深染。肌肽治疗组较再灌注损伤组损伤轻，肝细胞轻度水样变，见图1。 2. 血浆AST、ALT活性检测结果：休克组血浆AST、ALT活性显著高于假手术组，t值分别为2.17和2.84，P值均<0.05；再灌注损伤组血浆AST、ALT活性显著高于休克组，t值分别为6.84和5.93，P值均<0.01；肌肽治疗组血浆AST、ALT活性显著低于再灌注损伤组，t值分别为3.85和3.35，P<0.05和P<0.01。见表1。 3. 10％肝组织匀浆MDA、Na+-K+ATP酶检测结果：肌肽治疗组与再灌注损伤组MDA浓度分别为（1.14±0.12）nmol/mg和（1.48±0.27）nmol/mg；Na+-K+ATP酶活性分别为（0.14±0.04）μMPi·mg-1·h-1和（0.09±0.04）μMPi·mg-1·h-1，两组比较差异均有统计学意义，t分别为2.87和2.29，P值均<0.05。 三、讨论 目前IRI发生的机制还不是很明确，但普遍认为自由基损伤和钙超载是其重要的发病环节[4]。研究认为肌肽是目前发现的最好的既能抗氧化、抗自由基又具抗衰老作用的肽或蛋白质，且他对细胞的氧化应激损伤具有保护作用[1,5]。 血浆AST、ALT是反应肝脏损伤的重要酶学指标，本实验中我们观察到失血性休克大鼠在失血后1h血浆酶学指标比假手术组显著升高，输注自体血液复苏后3h导致血浆AST、ALT活性显著升高，而且肝脏发生明显组织病理损伤，说明大鼠失血性休克后输注自体血液复苏对肝脏造成了IRI。与再灌注损伤组相比肌肽治疗组大鼠血浆AST、ALT活性和MDA浓度显著降低，Na+-K+ATP酶活性显著升高，肝脏病理损伤减轻。说明肌肽对失血性休克再灌注后肝组织损伤具有保护作用。 在再灌注过程中，组织产生大量氧自由基，氧自由基通过膜脂质过氧化反应破坏细胞膜的结构，使细胞发生不可逆损伤。MDA是脂质过氧化的最终产物，对细胞具有直接的损伤作用，其含量的多少反映了机体内脂质过氧化损伤的程度。肌肽治疗组肝组织MDA浓度比再灌注损伤组显著降低，说明肌肽在肝组织有效地抑制了脂质过氧化反应强度，其机制可能和肌肽的抗氧化、清除自由基功能有关。 Na+-K+ATP酶是细胞膜上最容易受氧自由基影响的靶标之一。缺血时细胞氧化磷酸化减少可导致高能磷酸盐（ATP和肌酐）合成障碍，使Na+-K+ATP酶活性受到抑制，导致细胞内Na+浓度升高，激活Na+-Ca2+交换蛋白，Ca2+大量内流导致钙超载，钙超载是IRI发生的重要原因之一。有研究表明，肌肽能有效地保护Na+-K+ATP酶免受氧自由基的损伤[6]。本实验中肌肽治疗组Na+-K+ATP酶活性显著高于再灌注损伤组，验证了肌肽对Na+-K+ATP酶的保护作用，预示肌肽可能通过保护Na+-K+ATP酶的活性减轻钙超载从而起到减轻IRI的作用。 参 考 文 献 1Calabrese V, Colombrita C, Guagliano E, et al. Protective effect of carnosine during nitrosative stress in astroglial cell cultures. Neurochem Res, 2005, 30: 797-807. 2Fujii T, Takaoka M, Tsuruoka N, et al. Dietary Supplementation of L-carnosine prevents ischemia/reperfusion-induced renal injury in rats. Biol Pharm Bull, 2005, 28: 361-363. 3Guan LD, Wang GY, Wang ZL. Protective effect of N-acetyl-L-cysteine on ischemia-reperfusion injury of rats subjected to hemorrhagic shock. Zhongguo Yaolixue Yu Dulixue Zazhi, 2003, 17: 420-425. 管利东,王广义,王字玲.N-乙酰-L-半胱氨酸对失血性休克大鼠再灌注损伤的保护作用.中国药理学与毒理学杂志,2003,17:420-425. 4Toledo-Pereyra LH, Toledo AH, Walsh J, et al. Molecular signaling pathways in ischemia/reperfusion.Exp Clin Transplant, 2004, 2: 174-177. 5Wang AM, Zhou HB, Dong Q. Carnosine, a magic peptid. Shengming De Huaxue, 2004, 24: 314-316. 王爱民,周宏博,董钦.肌肽,一种神奇的小肽.生命的化学,2004,24:314-316. 6Stvolinsky SL,Kukley ML,Dobrota D,et al.Carnosine: an endogenous neuroprotector in the ischemic brain. Cell Mol Neurobiol, 1999, 19: 45-56. 《中华肝脏病杂志》版权 |